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癌症是21世纪人类健康面临的巨大挑战之一,近几十年针对癌症的治疗方法层出不穷,其中抗体药物作为里程碑式的治疗手段在癌症的治疗中发挥着巨大的作用,至今已有80多种药物被FDA批准上市。虽然抗体药物在肿瘤的治疗中占据着举足轻重的地位,但是随着临床研究的深入,传统的抗体药物在肿瘤治疗中的一些限制性逐渐暴露出来。主要体现在以下几个方面:(1)传统的抗体药物主要为IgG型抗体,分子量约为150 kDa,较大的分子形式导致抗体具有进入肿瘤部位量少、难以进入肿瘤深处以及在肿瘤部位分布不均一等缺点,从而导致药效不佳或肿瘤易于复发;(2)抗体药物较长的半衰期会增加潜在的脱靶毒性,造成较窄的治疗窗;(3)目前上市以及处于临床研究的抗体药物主要针对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA),这类抗原在肿瘤组织高表达,但是也会低表达于一些正常组织,这就会造成“on target&off tumor”脱靶效应,因此寻找肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)显得尤为重要。TSA由肿瘤突变(包括插入缺失、点突变以及基因融合等)产生,多数位于细胞内。胞内蛋白可被降解成多肤从而被主要组织相容性复合物I(MHC I)递呈到肿瘤表面形成多肽-组织相容性复合物(Peptide/MHC I complex,pMHC)。这类pMHC能特异性的区肿瘤细胞与正常细胞,但是一般情况下表达量很低。传统抗体药物(单克隆抗体和抗体偶联药物)抗肿瘤活性的发挥对抗原的数量有着一定要求(>3000),抗原数目较少会导致抗体药物药效不佳,所以靶向pMHC的传统抗体药物研发难度较大。随着分子生物学技术的发展以及基因工程技术的推动,抗体药物的形式已经不局限于传统的IgG型,出现了各种形式的小型化抗体。为了提高小型化抗体的抗肿瘤活性,小型化抗体不断往功能化抗体(抗体偶联药物和双特异性抗体)的方向拓展。因此,本研究从抗体的小型化及功能化角度,对上述提到的抗体药物存在的问题展开研究。首先,我们对Ofatumumab(OFA)进行小型化改造。我们利用基因工程技术构建了四种以抗原结合片段(Fab)为基础的小型化抗体Fab,2F(ab),Fab-CH2mut以及Fab-CH3mut。通过对小型化抗体进行初步评价最终选择Fab和Fab-CH3mut进行后续研究。我们利用Sortase A酶促定点偶联的方法制备了 Fab-vcMMAE(DAR～1),Fab-CH3mut-vcMMAE(DAR～1)以及OFA-vcMMAE(DAR～1.1)三种抗体偶联物并对三种抗体偶联物进行了综合的体内外评价。首先Fab-vcMMAE和Fab-CH3mut-vcMMAE均保留了部分OFA-vcMMAE的亲和力和内吞效率。Fab-vcMMAE(IC50 2.92 nM)与OFA-vcMMAE(IC50 1.31 nM)体外活性相当且明显高于Fab-CH3mut-vcMMAE(IC50 16.87 nM)。在体内实验中,虽然Fab-vcMMAE的给药剂量是OFA-vcMMAE的两倍,且Fab-vcMMAE(4/6裸鼠肿瘤消失)抗肿瘤活性略差于OFA-vcMMAE(6/6)。但是Fab-vcMMAE展现出较高的最大耐受剂量的优势,其有望在适当的给药剂量下达到与OFA-vcMMAE相同的抗肿瘤效果。体内生物分布结果显示Fab-vcMMAE与OFA-vcMMAE相比具有较快的肿瘤穿透速率以及相当的肿瘤部位聚集量。Fab-CH3mut-vcMMAE与Fab-vcMMAE相比,虽然药动学性质得到显著的改善但是由于抗体在肿瘤部位较低的聚集量导致抗肿瘤效果不佳,这可能与改造后Fab-CH3mut的单体的抗体形式有关。我们的研究结果证明了抗体片段偶联物在肿瘤治疗中的潜力,而且是一种有效解决传统抗体药物由于较大的分子形式在临床应用中出现的限制性问题,同时也为后续的小型化抗体的改造提供了指导。部分小型化的抗体偶联物由于较差的药动学性质,导致抗肿瘤效果不理想。为了提高其抗肿瘤活性,一方面可以通过蛋白融合改善药动学性质,一方面可以通过偶联活性更强的毒性分子。目前使用的活性较强的毒性分子如海兔毒素类、美登素类等IC50一般在pM级别,但更高毒性的分子难以获得。人体的免疫细胞在肿瘤治疗中有巨大的潜力,可以尝试将靶向T细胞的OKT3抗体与靶向肿瘤细胞的抗体偶联,从而得到T细胞依赖的双特异性抗体。双特异性抗体的抗肿瘤活性一般是ADC的100～1000倍,且其活性的发挥不依赖于抗体的内吞作用,所以可以将由于内吞性质较差(如OFA)或者不内吞造成抗肿瘤活性不理想的抗体开发成双特异性抗体。我们采用酶促-化学偶联的方法将OKT3抗体的Fab片段与Fab-CD20抗体片段进行偶联,从而得到双特异性抗体2F(ab,)-CD20-CD3。我们选择的酶促-化学偶联的方法不仅拓展了双特异性抗体的制备方法,而且与传统的制备方法相比能够确保异源二聚体的正确组装,有较高的偶联效率和易于分离纯化的优点。我们研究发现2F(ab’)-CD20-CD3抗体在与肿瘤细胞共孵育的条件下,能够特异性的激活T细胞,引起T细胞的增殖,并发挥对肿瘤细胞特异性的杀伤作用。体外活性结果显示2F(ab,)-CD20-CD3对Ramos和Daudi细胞的EC50分别为2.75 pM和2.62 pM。动物模型中,在1mg/kg的给药浓度下能显著的抑制肿瘤生长,其抗肿瘤活性显著高于Fab-vcMMAE。2F(ab’)-CD20(OFA)-CD3与目前文献报道的IgG形式的针对CD20的双特异性抗体(利妥昔)的体内外活性水平相当。此外缺乏抗体恒定区Fc的2F(ab’)-CD20-CD3抗体不仅具有较快的组织穿透性而且可以避免由于Fc的非特异性结合造成的毒副作用。虽然靶向CD20的小型化双特异性抗体展示了极高的活性,但是由于CD20也表达于正常的B细胞,故难以避免对正常细胞造成损伤从而造成毒副作用。为了进一步从安全性方面优化小型化抗体,我们选择肿瘤新生抗原-突变递呈肽/主要组织相容性复合物(pMHC)作为研究对象。这类pMHC抗原具有较高的特异性,但是由于较低的抗原表达水平导致传统的单克隆抗体或者ADC治疗效果不佳。对于T细胞而言,只需要10～100个抗原的刺激便能有效的激活并招募T细胞特异性的杀伤细胞表面抗原表达量较低的肿瘤细胞,因此双特异性抗体是针对特异性高但递呈量少的新生抗原中抗体药物靶向治疗的一个有效的补充。我们以KRAS G12V/HLA-A02-01作为研究靶点,利用酶促-化学偶联的方法制备了针对该靶点的2F(ab’)-2Gl-CD3抗体,初步的评价了双特性异性抗体的质量以及体外生物活性。2F(ab’)-2G1-CD3在体外对的抗原递呈量很少(<300)的SW480(KARS G12V/HLA0201)细胞有明显的杀伤作用(EC50～31.5 nM),而对 A375(KRAS Wildf/HLA0201),K562-A2(KARS Wild/HLA0201)和 K562-A3(KARS Wild/HLA0301)没有杀伤作用,说明靶向肿瘤特异性pMHC的双特异性抗体的在保持良好活性同时提高了特异性。IgG形式的2G1×CD3在1 mg/kg给药浓度下显著的抑制小鼠移植瘤的生长,预示了 2F(ab’)-2G1-CD3在体内具有较好的抗肿瘤活性。我们的研究为靶向低表达、高特异的肿瘤新生抗原的药物研发提供新方案。本研究从抗体药物的实际缺陷出发,在小型化抗体的基础上,通过对抗体片段进行功能化修饰,得到了活性强、安全性高的多种小型化抗体药物。我们的研究结果证明小型化抗体偶联药物及小型化双特异性抗体是解决传统抗体药物由于较大的分子形式、靶点特性及抗原数目在治疗中展现的限制性的有效形式。