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禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的多种肿瘤性疾病的总称。A亚群禽白血病病毒(ALV-A)、B亚群禽白血病病毒(ALV-B)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是感染鸡的最常见的三种ALV。禽白血病是危害我国养禽业的重要的种源性遗传病,目前,该病没有可用的疫苗和药物,主要通过种群净化来防控。抗体检测是ALV检测的重要手段。为此,本研究建立了A/B亚群ALV ELISA抗体检测方法和J亚群ALV ELISA抗体检测方法,可为禽白血病的有效防控与净化提供技术支持。为了制备ELISA抗体检测方法的包被抗原,首先分别建立了稳定表达ALV-A、ALV-B和ALV-J gp85的293F细胞系。以毒株RAV-1(ALV-A)、RAV-2(ALV-B)、HLJ09MDJ-1(ALV-J)的cDNA为模板,通过PCR扩增获得gp85基因,并将其分别克隆到pLVX载体上,获得慢病毒表达质粒pLVX-A-gp85、pLVX-B-gp85和pLVX-J-gp85。分别用三个亚群gp85慢病毒表达质粒与psPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞包装慢病毒。将收获的慢病毒分别感染293F细胞,之后进行流式细胞分选,分选后表达绿色荧光的293F细胞比例达到了90%以上。将分选的细胞继续培养5 d,经Western Blot检测细胞上清蛋白分泌结果表明,细胞系能分泌gp85蛋白至上清中。稳定性检测结果表明,绿色荧光蛋白和ALV gp85蛋白均可在第5、10和15代293F稳定表达细胞系中稳定表达。这些结果表明,表达gp85蛋白的293F稳定细胞系成功建立。经计算三个亚群gp85蛋白在细胞系中的表达量约为30mg/L。稳定表达细胞系表达的ALV-A和ALV-B的gp85蛋白以1:1的比例作为包被抗原,建立了A/B亚群ALV ELISA抗体检测方法。该方法不与ALV-J及其他常见感染禽类的病毒阳性血清反应,特异性好于IDEXX试剂盒。该方法检测ALV-A血清的敏感性(1:6400)为间接免疫荧光实验(IFA)(1:1600)的4倍;检测ALV-B血清的敏感性(1:12800)为IFA(1:1600)的8倍。重复性试验结果表明,该方法检测阳性血清批间和批内的变异系数均≤10%,稳定性好。对1428份临床血清检测结果表明,该ELISA方法与IFA的符合率为99.51%。以稳定表达细胞系表达的ALV-J gp85蛋白作为包被抗原,建立了检测J亚群ALV ELISA抗体检测方法。该方法不与ALV-A和ALV-B及其他常见感染禽类的病毒阳性血清反应,特异性优于IDEXX试剂盒。该方法的敏感性(1:51200)为IDEXX试剂盒(1:25600)的2倍,为IFA(1:3200)的8倍。批间和批内检测变异系数均≤10%。使用该方法与IFA共检测临床血清1180份,两者的符合率为98.31%。本研究成功构建了能稳定表达ALV-A、ALV-B和ALV-J gp85蛋白的293F细胞系,以细胞系表达纯化的gp85蛋白作为包被抗原,成功建立了检测A/B亚群ALV ELISA抗体检测方法和J亚群ALV ELISA抗体检测方法,这两个方法特异性强,敏感性高,稳定性好,与IFA的符合率高,为ALV的血清学监测、诊断和净化提供了重要技术手段。