SIRT7作为去乙酰化蛋白家族一员,是一种NAD+依赖性脱乙酰酶,定位于核仁,参与多种生物学过程,包括rRNA和蛋白质合成、DNA损伤反应、细胞应激以及肿瘤的发生等。有研究表明SIRT7在LPS致炎的THP-1细胞中表达降低,在甲状腺癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌以及乳腺癌等组织中高表达,被认为是一种潜在的癌症因子,但SIRT7在乳房炎和乳腺癌中的研究较少,具体的调控机制还不清楚。因此本研究将通过构建敲低和过表达SIRT7的细胞模型,深入研究SIRT7对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的作用和分子机制,以及SIRT7对人乳腺癌细胞的生长调控机制,为奶牛乳房炎和人类乳腺癌分子诊治提供新靶点及新线索。研究结果主要包括以下几个部分:1、SIRT7降低LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤奶牛乳腺组织的健康直接关乎着养殖者的经济效益和乳品质量。尽管预防和治疗方法已经实施了几十年,但奶牛乳房炎仍然是一种棘手的疾病。LPS是引起奶牛乳房炎症反应的关键细胞毒性因子。所以急需发展有效控制LPS引起奶牛乳房炎的新型药物和疫苗等。本试验中我们分别采集5头炎症和5头正常奶牛乳腺组织,通过Western blot检测发现患临床性乳房炎的奶牛乳腺组织SIRT7明显低表达。同时体外培养奶牛乳腺上皮细胞,加入LPS（1 μg/mL）诱导炎症反应,6 h后收集细胞,进行qRT-PCR、Western blot检测。结果显示,LPS处理后,SIRT7表达明显降低。同时通过siRNA敲低SIRT7后促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显升高;荧光标记也表明敲低SIRT7显著增加LPS刺激引起的炎性介质（ROS和NO）的分泌;然而,过表达SIRT7则显著抑制LPS诱导的促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和炎性介质（ROS和NO）的产生。因此我们可以得出,在LPS致炎的奶牛乳腺上皮细胞中,SIRT7通过调控促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和炎性介质（ROS和NO）的分泌,降低炎性损伤。2、SIRT7抑制LPS引起的NF-κB信号通路的激活和降低细胞凋亡哺乳动物的炎症反应是防御侵入病原体的复杂生物学、生理学和病理学反应。过度的炎症反应会引起细胞凋亡、宿主组织损伤和疾病。LPS通常导致NF-κB信号通路的激活,促进细胞凋亡。为了检测SIRT7对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞NF-κB信号通路的激活情况,我们首先检测其上游因子TLR4、TAB1和p-TAK1的表达。结果表明,敲低SIRT7显著促进LPS诱导的TLR4和TAB1的mRNA和蛋白表达的增加以及TAK1的磷酸化;而过表达SIRT7显著阻滞LPS诱导的TLR4和TAB1的mRNA和蛋白表达的增加以及TAK1的磷酸化。通过Western blot检测结果表明,LPS激活NF-κB通路,导致NF-κB p-p65显著增加,敲低SIRT7进一步增加NF-κB p65的磷酸化,而过表达则显著抑制NF-κB p65的激活,降低NF-κB p-p65的表达。细胞免疫荧光染色结果表明,LPS刺激后,NF-κB p65发生核易位。当敲低SIRT7时,促进NF-κB p-p65的核转移,而过表达SIRT7则抑制NF-κB p-p65核转移。同时通过Western blot分别检测细胞核和细胞质中NF-κB p-p65水平,结果与免疫荧光染色结果一致。LPS可诱导严重的炎症反应并对乳腺组织和乳腺上皮细胞造成损伤。通过流式细胞仪检测细胞凋亡,结果表明敲低SIRT7显著增加LPS诱导的乳腺上皮细胞的凋亡,而过表达SIRT7则显著抑制LPS诱导的细胞凋亡;同时敲低SIRT7显著促进LPS诱导的细胞中的Bax/Bcl-2比率的增加。反之,过表达SIRT7显著降低了 Bax/Bcl-2 mRNA比率以及Bax和cleaved-caspase-3的蛋白水平。以上结果表明SIRT7通过抑制LPS诱导的NF-κB通路的激活,从而降低促炎性因子的分泌以及降低细胞凋亡。因此,SIRT7在炎症诱导的乳腺组织和乳腺上皮细胞的损伤中起关键作用。3、SIRT7对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、迁移和凋亡的作用乳腺癌是世界各地女性癌症死亡的主要原因之一。探索能有效预防乳腺癌发生的新型分子机制具有重要意义。为了探索SIRT7在乳腺癌细胞中的生物学功能,我们设计了 SIRT7 靶向 siRNA 和过表达载体 pcDNA3.0-SIRT7,并通过 Lipofectamine 2000转染MCF-7和MDA-MB-231细胞用于敲低和过表达SIRT7。CCK-8和EDU检测结果表明,敲低SIRT7显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖,而过表达SIRT7显著促进MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖。同时通过划痕和Transwell试验检测细胞迁移,结果表明敲低SIRT7显著抑制细胞的迁移,而过表达SIRT7则显著促进细胞的迁移。根据以上结果,我们猜测敲低和过表达SIRT7可以通过引起细胞周期的变化和细胞凋亡从而影响细胞的增殖和迁移。首先,通过流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡,结果表明敲低SIRT7后处于G1期的细胞显著增多,同时显著减少S期细胞。而过表达SIRT7则显著降低G1期细胞百分比,并增加S期细胞,表明SIRT7促进MCF-7和MDA-MB-231细胞中G0/G1期到S期的转变。同时细胞凋亡也发生了变化,敲低SIRT7引起细胞凋亡,而过表达SIRT7则对细胞凋亡无影响。为了进一步研究SIRT7调控MCF-7和MDA-MB-231细胞周期和细胞凋亡的机制,我们通过qRT-PCR检测调控细胞周期关键基因CDK4/6和CyclinD1/2 mRNA的表达。结果表明,敲低SIRT7 后,CDK4/6 和 CyclinD1/2 mRNA 水平显著降低;而过表达 SIRT7 后,CDK4/6、CyclinD1/2 mRNA表达显著增加。这些结果表明SIRT7在细胞周期进程中的作用依赖于G1/S转换的CDK4/6-CyclinD1/2的表达。同时我们检测了一些凋亡相关基因Bax,Bcl-2 和 cleaved-caspase-3 的表达。结果表明,敲低 SIRT7 后,Bax/Bcl-2 mRNA 表达显著增加,Bax/Bcl-2和cleaved-caspase-3的蛋白水平也增加,同时增加p-p38MAPK和cleaved-Parp1的蛋白水平,激活p38MAPK信号通路,这说明敲低SIRT7可激活凋亡相关信号通路,从而引起细胞凋亡的发生。以上结果表明,SIRT7通过调控细胞周期、细胞凋亡相关基因和蛋白的表达,以及p38MAPK的磷酸化,在乳腺癌细胞的增殖、迁移和细胞凋亡过程中发挥作用。4、敲低SIRT7抑制MDA-MB-231细胞裸鼠成瘤及增加阿霉素的敏感性体外建立肿瘤模型进行防治研究,是基础医学研究中的重要课题。在本研究中,通过慢病毒感染MDA-MB-231细胞建立稳定敲低SIRT7的细胞系,用于裸鼠皮下成瘤试验。结果表明,稳定敲低SIRT7的MDA-MB-231细胞经皮下注射后,肿瘤生长速度较慢;瘤体被剥离裸鼠后,通过HE染色观察发现敲低SIRT7后组织显著疏松,呈现许多空隙。同时Tunel荧光染色观察发现,敲低SIRT7组的瘤体组织有较多被绿色荧光标记的细胞。说明敲低SIRT7的MDA-MB-231细胞在裸鼠皮下成瘤时可能会导致细胞凋亡。阿霉素（Doxorubicin,DOX）的副作用极大地限制了 DOX的应用,阻碍了乳腺癌的治疗。当细胞通过皮下注射后,肿瘤块逐渐形成,第七天时,开始通过腹腔注射DOX,每三天一次。随着药物的注射,肿瘤体积开始变小,敲低SIRT7组比对照组体积减小得更快,当注射到25天时,出现显著差异。通过HE染色观察发现敲低SIRT7组瘤体组织完全不能连接成片,呈现大部分空隙状态。同时有较多细胞被Tunel绿色荧光标记,这表明敲低组与对照组相比,有较多的凋亡细胞,说明敲低SIRT7能够增强DOX的药效,促进MDA-MB-231对DOX的敏感性。根据以上的结果,我们认为敲低SIRT7可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤的形成,提高对药物DOX的敏感性。