疟疾是一种由疟原虫感染引起并经按蚊传播的寄生虫病,每年造成40余万人死亡。疟原虫是单细胞原虫,生活周期经历两个宿主:雌性按蚊和哺乳动物。在这两个宿主体内的交替寄生和发育过程中,伴随着疟原虫多种细胞形态的转化,这些转化依赖于基因表达的精确调控。疟原虫在按蚊体内发育的早期,出现了三次细胞形态转化。当疟疾病人被按蚊叮咬时,雌雄配子体进入按蚊消化道中。在此,雌/雄配子体被激活成雌/雄配子,雌/雄配子受精后形成合子,这是第一次形态转化;第二次形态转化发生在合子转化成动合子的过程中;动合子穿越中肠上皮定殖于体腔侧,形成卵囊,完成第三次形态转化。上述细胞形态转化过程中,调控基因表达的转录因子和相关机制尚未阐述清楚。ApiAP2蛋白是疟原虫中最主要的转录因子家族,包含26个成员,参与了疟原虫生活史不同阶段的基因转录调控。在之前的研究中,我们使用CRISPR/Cas9技术,通过反向遗传学的手段,系统分析了鼠约氏疟原虫17XNL虫株26个ApiAP2成员的表达和功能。本文将对影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的三个转录因子(AP2-O3、AP2-O4和AP2-O2),进行详细功能阐述。ap2-o3基因敲除后,配子体生成和雄配子体出丝过程正常;但动合子转化能力显著降低,且没有成熟动合子产生;重要的是,△ap2-o3虫株不能建立按蚊感染,致使疟原虫按蚊传播阻断。蛋白表达分析显示,AP2-O3只在配子体时期表达,无性期和动合子时期不表达;此外,AP2-03特定表达于雌配子体,并且定位于细胞核。将△ap2-o3虫株分别与雌/雄配子体缺陷虫株杂交发现,AP2-O3只影响了雌配子体的激活,雄配子体激活不受影响。ap2-o3敲除后,雌配子体激活过程中P28基因转录本翻译抑制的解除受到影响,进一步确认了 AP2-O3在雌配子体激活中的作用。此外,在另一个虫株敲除ap2-o3,也重复出相同结果。疟原虫生活周期的蛋白表达分析发现,AP2-O3表达阶段和疟原虫生活周期不同发育阶段的基因组DNA复制呈现明显的负相关:AP2-O3只表达在雌配子体和成熟卵囊两个阶段,正好是疟原虫缺失DNA复制的两个阶段。野生型和△ap2-o3虫株的雌配子体转录组比较发现,DNA复制和修复通路多数基因的转录水平在ap2-o3敲除后上调,荧光定量PCR分析了上调的26个基因,结果和转录组分析一致。在雌配子体激活形成的合子细胞中,AP2-O3阴性的细胞核倍性明显高于AP2-O3阳性的细胞核;进一步在合子细胞中过表达AP2-O3,导致细胞核倍性停止从2N向4N增加,与此同时,合子转化为成熟动合子显著下降。上述结果表明,AP2-O3转录抑制DNA复制和修复的基因表达,从而调控疟原虫DNA复制。在ap2-o3敲除后转录水平显著下调的270个基因中,我们选择了两个功能未知的基因(lc6和zk11)进行了深入分析。ap2-o3敲除后,雌配子体中lc6和zk11基因的转录水平和蛋白水平均显著下调。进一步分析发现,基因敲除虫株△ lc6和△ zk11均具有正常的配子体生成和雄配子体出丝能力,但动合子转化能力显著降低,蚊期中肠卵囊发育严重受阻,这与△ap2-o3表型一致。上述结果表明,AP2-O3通过转录激活lc6和zk1 1调控动合子发育。ap2-o4敲除虫株的表型分析显示,其无性期,配子体和动合子发育均与野生型一致;然而,感染按蚊后完全没有卵囊形成。从p28::mCherry出发的ap2-o4敲除虫株进入按蚊中肠后,其卵囊数量随着发育时间而减少,最终不能形成卵囊。生活周期蛋白表达分析表明,AP2-O4在除无性期以外的整个生活周期均有表达,且定位于细胞核。这表明AP2-O4可能调控了参与动合子转化成卵囊这一阶段的基因转录。对17XNL和△ap2-o4的配子体和动合子时期样本进行转录组分析发现,ap2-o4敲除后有数百个基因的转录水平发生了变化。荧光定量PCR分析部分ap2-o4敲除后转录下调的基因,确认了转录组分析结果。ap2-o2敲除后,无性期、配子体及动合子发育均与野生型一致,感染按蚊后卵囊数量和唾液腺子孢子数量显著下降。在p28::mCherry虫株敲除ap2-o2,其进入按蚊寄生的早期具有正常数量的卵囊,发育到中期时卵囊数量较野生型显著降低。生活周期蛋白表达分析表明,AP2-O2表达于除成熟动合子以外的其他时期,且是细胞核定位。以上结果表明,AP2-O2可能参与调控了疟原虫蚊期发育必需基因的表达。AP2-O2,AP2-O3和AP2-O4这三个转录因子调控疟原虫在按蚊寄生的早期发育。疟原虫蚊期发育是疟疾传播的必需过程,该阶段特别是早期阶段的基因表达调控的深入研究,有助于寻找疟原虫发育的关键基因,为疟疾药物的研发提供新的作用靶标。