论文部分内容阅读
第一部分BLM基因的筛选及其对胆管癌进展的影响目的:胆管癌（CCA）是消化系统最常见的肿瘤之一,由于它具有进展迅速、恶性程度高等特点,胆管癌患者的预后往往很差。因此潜在的生物标记物及药物靶点亟待发现。为了探索胆管癌的发病机制,我们通过分析公共数据库中的胆管癌样本的基因组图谱,并结合生物信息学方法来寻找新的与胆管癌发生、发展及预后相关的重要基因。方法:从癌症基因组图谱（TCGA）中获得胆管癌样本及癌旁组织的基因表达谱数据以及肿瘤样本临床资料。采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来寻找肿瘤样本中差异表达基因之间的相似性,并把表达模式高度相近的基因归纳入同一个基因模块。在将不同的基因模块与临床性状相关联后,确定与胆管癌进展最相关的基因模块,并对该模块中的所有基因进行Gene Ontology及KEGG通路分析。然后结合蛋白-蛋白互作（PPI）分析结果与共表达分析结果鉴定出数个候选枢纽基因。通过对这些候选枢纽基因在内部和外部数据集中进行表达量和预后影响的验证,筛选得到最终的枢纽基因。最后,根据不同样本中枢纽基因的表达,将肿瘤样本分为高表达组和低表达组,使用基因集富集分析（GSEA）的方法探索枢纽基因可能参与的调控胆管癌进展的信号通路与机制。结果:基于6219个癌旁与胆管癌组织之间的差异表达基因,我们利用WGCNA算法在肿瘤样本的基因表达谱中一共划分出29个基因模块。其中蓝色模块是与胆管癌临床性状最相关的基因模块。针对该模块中基因的Gene Ontology及KEGG通路分析结果显示蓝色模块中的基因主要参与细胞周期的调控及癌症发生相关的通路。蓝色模块中鉴别出来的5个候选枢纽基因BLM、GGH、RPS3、NUP107和CCT2,在经过内部和外部数据集验证后,得到一个最终的枢纽基因BLM。GSEA的结果显示,在胆管癌中BLM参与调控细胞周期与细胞增殖相关过程。结论:BLM与胆管癌的不良预后及恶性进展密切相关,可能参与了细胞周期及细胞增殖相关通路的调控。第二部分枢纽基因BLM对胆管癌生物学行为的影响及机制研究目的:在体外及体内实验中验证BLM的表达,并探究其对胆管癌进展的影响。方法:RT-q PCR法和WB法分别检测胆管癌细胞系QBC-939、RBE及正常胆管上皮细胞Hi BEC中枢纽基因BLM的m RNA表达水平和蛋白表达水平。免疫组织化学方法检测BLM蛋白在胆管癌组织芯片中癌及癌旁组织表达情况。在胆管癌细胞系QBC-939和RBE细胞中转染BLM的小干扰RNA。通过CCK-8实验检测转染后细胞的增殖活性;划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移能力。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的改变。使用短发夹RNA（sh RNA）质粒构建BLM低表达细胞株,用于建立裸鼠异种移植瘤模型,对比观察转染后细胞在体内生长能力的改变。结果:BLM在胆管癌组织以及胆管癌细胞系中高表达。体外细胞实验表明下调BLM的表达可以抑制胆管癌细胞的增殖和迁移。流式细胞学检测细胞周期后发现,敲低BLM表达会导致胆管癌细胞出现G2期阻滞;下调BLM表达后,凋亡细胞比例增加。在裸鼠异种移植瘤模型中,BLM敲低抑制了肿瘤在裸鼠体内的生长。结论:BLM提高了胆管癌细胞的增殖、迁移能力,推动了肿瘤细胞周期进展,抑制胆管癌细胞凋亡,并增强了肿瘤的生长能力,从而促进了胆管癌的进展。第三部分靶向BLM的miRNA预测及验证其对BLM表达的影响目的:miRNA作为细胞内重要的非编码RNA,参与调控众多基因的表达。本章中我们鉴定出靶向调控BLM基因的miRNA,探究其对BLM表达的影响。方法:应用常用的生物信息学在线数据库miRDB、miRWalk、Tar Base以及Target Scan,分别预测靶向BLM的miRNA,取其交集后得到共有的预测miRNA,即miR-628-5p。进一步预测其与BLM的结合位点,并通过应用RT-q PCR法在胆管癌细胞系QBC-939、RBE和正常胆管上皮细胞Hi BEC中检测miR-628-5p的表达。分别构建搭载野生型BLM 3’UTR区域和突变型BLM 3’UTR区域的荧光素酶报告基因质粒,观察突变型质粒和野生型质粒分别和miR-628-5p mimic共转染时,荧光素酶活性变化情况。miR-628-5p mimic和inhibitor分别转染胆管癌细胞系,以上调和下调miR-628-5p的表达,观察其对BLM表达的影响。结果:生物信息学预测分析miR-628-5p可以靶向作用于BLM。miR-628-5p在Hi BEC中的表达量要显著低于胆管癌细胞QBC-939和RBE。突变型质粒载体表达的荧光素酶活性不受miR-628-5p mimic的影响,而野生型的质粒载体其荧光素酶活性显著下降。转染miR-628-5p的mimic或inhibitor后,胆管癌细胞中BLM的蛋白及m RNA表达量分别下降和升高。结论:在胆管癌中,miR-628-5p可以通过靶向作用于BLM来调控肿瘤细胞的表达,影响胆管癌的恶性进展。这一新的机制为胆管癌的诊疗提供了新思路,将来有望利用该机制指导临床靶向治疗和精准治疗。