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点击反应是一类高效、简单的化学反应总称,主要是利用小单元的连接,高效快速的完成多种分子的合成。在所有点击反应中,亚铜离子催化叠氮基和炔基的Huisgen-1,3-偶极环加成反应(Copper(I)-Catalyzed Azide/Alkyne Cycloaddition,CuAAC)最为经典。在亚铜离子的催化下,叠氮基和炔基化合物能够快速的发生CuAAC反应,生成具有特殊性质的1,2,3-三唑类产物。该反应不仅操作简单,产率高,而且化学选择性好。香豆素荧光探针技术在生物化学领域应用十分广泛,该技术灵敏度高,选择性好。在此,我们基于点击化学原理利用香豆素荧光探针技术对β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、脂肪酶的活性检测方法进行了探索。本文的工作主要从以下几个方面进行展开:1、合成4-甲基-7-乙炔基香豆素荧光探针分子。通过间苯二酚和乙酰乙酸乙酯合成荧光较强的4-甲基-7-羟基-香豆素,然后经3步反应将7位的羟基转化成具有吸电子效应的乙炔基,生成荧光猝灭的4-甲基-7-乙炔基香豆素荧光探针分子,每步产率均在70%以上。2、合成酶水解底物2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)以及抗坏血酸硬脂酸酯。通过1-溴-2,3,4,5-四乙酰基葡萄糖和3,5,6-位保护的抗坏血酸进行反应及相应的脱保护过程,合成β-葡萄糖苷酶水解底物AA-2βG。同样利用3,5,6-位保护的抗坏血酸与硬脂酸酰氯进行反应及相应的脱保护过程,成功合成脂肪酶水解底物抗坏血酸硬脂酸酯。3、探索酶动力学性质。对β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、脂肪酶水解条件如温度、缓冲液pH值、底物浓度、水解时间、金属离子、有机溶剂的探索,得到它们的最佳水解条件。结果表明,β-葡萄糖苷酶水解AA-2βG最佳条件:温度45℃,缓冲液pH=5.0,底物AA-2βG浓度300 mmol/L,水解时间30 min;碱性磷酸酶水解抗坏血酸磷酸酯钠最佳条件:温度37℃,缓冲液pH=10.0,底物抗坏血酸磷酸酯钠浓度1000mmol/L,水解时间15 min;脂肪酶水解反应最佳条件为:温度45℃,缓冲液pH=6.0,底物浓度200 mmol/L,水解时间30 min。4、通过点击反应和香豆素荧光探针技术相结合对β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、脂肪酶活性进行检测。在此体系中,酶能够特异性水解相应的抗坏血酸衍生物,产生游离态的抗坏血酸,将二价铜离子还原成一价亚铜离子,从而催化弱荧光强度的4-甲基-7-乙炔基香豆素和叠氮反应,生成高荧光强度的三氮唑香豆素,体系荧光强度发生变化,根据荧光信号变化反映酶活性。实验结果显示,β-葡萄糖苷酶活性在1~40 U/L范围内,酶活性与荧光增强强度有线性关系,检测限为0.456 U/L。同样对碱性磷酸酶活性进行检测,发现碱性磷酸酶活性在0.25~10 U/L范围内,酶活性与荧光增强强度有线性关系,检测限为0.034 U/L,利用该方法,对市售蒙牛及伊利纯牛奶中碱性磷酸酶含量进行了检测,结果表明,蒙牛及伊利纯牛奶中碱性磷酸酶含量低于国际牛奶检测标准0.35 U/L,两种牛奶产品灭菌达标。最后,对脂肪酶活性进行了检测,发现脂肪酶活性在6~48 U/mL,酶活性与荧光增强强度有线性关系,检测限为0.3 U/mL。该方法灵敏度高,选择性好,检测速度快,是一种新型的酶活性检测方法。