研究背景:脑血管病是威胁人类健康与生存的主要神经性疾病之一,其中以脑卒中最具代表性,具有高发病率、高死亡率、高残疾率等特点,给患者及其家庭生活质量带来严重影响。目前临床上广泛用于治疗缺血性脑卒中的溶栓药物重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA),由于rt-PA的治疗时间窗(<4.5h)狭窄及在超出治疗时间窗后给予rt-PA溶栓治疗易导致颅内出血,所以对于严重的中风患者及高龄患者,只有3～5%的患者能够达到一个安全有效的治疗。由于溶栓治疗所带来的副作用,人们提出了神经元保护策略,希望通过延长治疗时间窗或者增加神经元耐受性,有效降低甚至逆转脑缺血造成的损伤。但遗憾的是目前为止临床上用于治疗缺血性脑卒中的神经保护药物都存在一定缺点。因此,寻找更多有效预防、治疗缺血性脑卒中的神经保护药物很有必要。本实验室前期制备的两种β-1,4及β-1,3糖苷键连接的线性葡萄糖醛酸寡糖,对糖氧剥夺造成的HT-22神经元细胞损伤具有保护作用,但该两种寡糖中包括聚合度为2～9的寡糖醛酸。考虑到寡糖的糖元构型、连接方式、聚合度等均有可能影响其生物活性,确定其结构与神经元保护活性之间的构效关系对开发同类药物具有重要意义。实验目的:比较葡萄糖醛酸寡糖连接方式及聚合度对糖氧剥夺造成的神经细胞损伤的保护活性的影响,阐述葡糖醛酸寡糖神经保护作用的的构效关系并筛选出活性寡糖片段。研究方法:根据寡糖混合物结构分别采用凝胶渗透色谱法及强阴离子交换色谱法分离得到单一聚合度β-1,4及β-1,3寡糖醛酸;建立糖氧剥夺细胞损伤模型,比较β-1,4及β-1,3单一聚合度寡糖醛酸对OGD处理下HT-22神经细胞损伤的保护作用;以荧光定量分子生物学手段初步探索寡糖醛酸发挥抗脑卒中神经细胞保护活性的作用机制。实验结果:1、采用凝胶渗透色谱法及强阴离子交换色谱法分离纯化得到单一聚合度P-1,4及β-1,3葡萄糖醛酸寡糖,并利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Q/TOF-MS)对分离得到的产物进行结构鉴定及纯度分析,数据表明得到的单一聚合度寡糖纯度较高,可用于后期活性实验。2、成功利用糖氧剥夺HT-22细胞损伤建立脑卒中体外模型;利用该模型实验,结果显示β-1,4及β-1,3系列寡糖醛酸均呈现随着聚合度的增加,神经保护作用增加的趋势,其中七糖、八糖、九糖可以显著逆转糖氧剥夺引起的神经元损伤,且P-1,4葡萄糖醛酸寡糖效果优于β-1,3。3、糖氧剥夺处理不同时间段,β-1,4及β-1,3葡萄糖醛酸寡糖均能很好的保护HT-22神经细胞损伤,其中β-1,4及β-1,3的七糖、八糖、九糖的保护作用最明显,且呈剂量依赖性。4、聚合度为2～9时,高聚合度的β-1,4及β-1,3葡萄糖醛酸寡糖可以逆转糖氧剥夺导致的神经细胞内ROS的增加及ATP的减少。线粒体是细胞内能量供应直接场所,推测β-1,4及β-1,3葡萄糖醛酸寡糖可能是通过减少自由基损伤及线粒体功能障碍来达到神经保护作用。实验结论:以上实验说明,糖基组成一致但连接方式不同的葡萄糖醛酸寡糖在抗脑卒中神经保护活性上表现不同,β-1,4寡糖醛酸活性略优于β-1,3型糖醛酸寡糖,且高聚合度的β-1,4寡糖醛酸抗糖氧剥夺造成的神经细胞损伤效果更好。本研究为葡萄糖醛酸寡糖的脑卒中神经元保护构效关系及机制研究提供有限参考,在一定程度上为抗缺血性脑卒中疾病的神经保护药物研发提供了研究方向。