2型糖尿病患病率的快速增长是整个社会正面临的重大公共卫生问题,在全球范围内提高了卫生经济支出,给卫生保健和疾病治疗带来巨大压力。尽管2型糖尿病患者以高血糖及糖化血红蛋白水平升高为特征,但这些临床生化指标的改变在体内代谢紊乱之后才会发生水平改变,而组织葡萄糖稳态及胰岛素敏感性异常在诊断数年前就已出现。鉴于2型糖尿病沉重的疾病负担及复杂的病理特征,现阶段研究的热点是探索循环micro RNA（mi RNA）作为糖尿病诊断及预后生物标志物。既往研究发现血浆mi RNA如mi RNA-122在糖尿病早期即发生差异表达,且越来越多的功能研究证明,mi RNA在糖尿病发生发展过程中发挥重要作用。蛋白质是生命活动的主要承担者,是细胞行使功能的重要分子。基于质谱蛋白组学方法,发现血浆低丰度蛋白如脂联素和抵抗素等与2型糖尿病发病风险有关,后续研究也表明这些低丰度蛋白参与了糖尿病的发生发展,是组织或细胞功能异常的直接效应分子。然而以往的大部分研究均分别探讨血浆mi RNA和血浆蛋白质的水平差异,鲜有研究在同一人群中同时探讨血浆mi RNA和蛋白质水平差异及二者潜在的关联和潜在的生物学机制。基于上述研究背景,本研究纳入2008年建立的东风-同济队列人群随访至2013年新诊断未用药的113位糖尿病病例,并按照年龄和性别1:1匹配的113位健康对照。首先探索了血浆中差异表达mi RNA,并进行靶基因及靶基因富集信号通路的生物信息学分析;然后采用蛋白组学方法探索了相同人群血浆中mi RNA靶基因编码蛋白的差异表达情况;最后基于人群血浆mi RNA与蛋白关联结果及mi RNA生物信息学分析结果,在体外实验中验证血浆mi RNA对差异表达蛋白的靶向作用,并进一步探索了血浆差异表达mi RNA在细胞中的功能。本论文主要包括下面三个部分:第一部分血浆mi RNA水平与2型糖尿病关联的病例-对照研究目的:在糖尿病病例-对照研究中探索血浆差异表达mi RNA-及mi RNA与糖尿病患病风险的关联。方法:本研究基于2008年建立的东风-同济队列,研究人群来自2013年第一次随访新诊断且未用药的113名糖尿病病例及按照年龄和性别1:1配对的113名健康对照,采用流行病学问卷调查获取研究对象一般人口学特征和生活方式等信息。发现阶段:在15对病例-对照样本中采用mi RNA芯片筛选差异表达mi RNA,验证阶段:在98对病例-对照人群中采用Taq Man实时定量PCR验证发现阶段筛选出部分差异mi RNA。采用配对t检验或Wilcoxon秩和检验比较两组间mi RNA表达差异,采用多因素logistics回归模型校正年龄、性别、体质指数、吸烟状况,饮酒状况、体力活动以及糖尿病家族史,计算mi RNA与糖尿病患病风险的关联;利用受试者工作特征曲线下面积（Area under the receiver operating characteristic curve,AUC）分析mi RNA对2型糖尿病的判定能力。结果:发现阶段的15对病例对照的芯片研究结果显示有167个mi RNA在两组之间差异表达。验证阶段根据差异比较的倍数（>2）和P值（P<0.0001）选择了前12个差异表达mi RNA进行验证。验证阶段的98对病例对照组中仅4个mi RNA得到完整表达量数据,分别为mi R-193b-3p、mi R-26b-3p、mi R-4739和mi R-197-5p。在校正了cel-mi R-39表达量后,未发现其他三个mi RNAs与糖尿病有统计学关联,但糖尿病患者血浆mi R-193b-3p水平显著高于健康人群（P=0.006）,在健康人群中发现血浆mi R-193b-3p水平与甘油三脂（TG,r=0.283,P<0.01）、总胆固醇（CHOL,r=0.185,P<0.05）、空腹血糖（FPG,r=0.274,P<0.01）、糖化血红蛋白（Hb A1c,r=0.237,P<0.01）和淋巴细胞数量（r=0.277,P<0.01）均呈显著正相关。校正糖尿病传统危险因素后,mi R-193b-3p水平增加,糖尿病患病风险增加比值比（Odd Ratio,OR）及95%置信区间（Confidence intervals,CI）为2.95（1.37,6.39）,P=0.006。进一步校正甘油三酯和总胆固醇水平（OR:2.41,95%CI:1.15-5.03,P=0.019）和淋巴细胞数量（OR:2.85,95%CI:1.23-6.6;P=0.015）得到了同样的分析结果。单独采用mi R-193b-3p诊断糖尿病,模型AUC为0.68。利用mi RDB、Target Scan和mi RTar Base三个数据库预测mi R-193b-3p靶基因,共计992个基因编码的m RNA含有mi R-193b-3p靶作用位点,其中82个靶基因被至少2个数据库预测。KEGG富集分析提示mi R-193b-3p靶基因主要集中在PI3K-Akt信号通路。结论:2型糖尿病患者血浆mi R-193b-3p水平显著升高,与糖尿病患病风险存在显著关联。基因富集分析以及和临床生化指标的关联研究提示mi R-193b-3p可能与糖类和脂类代谢相关。第二部分2型糖尿病血浆蛋白组学研究目的:探索第一部分人群血浆中差异表达mi RNA预测的靶基因编码蛋白的差异表达情况,为后续mi RNA功能研究提供线索。方法:本部分研究对象与第一部分一致,为113对新发糖尿病病例和对照血浆样本。将113对病例对照样本随机分为筛选样本（N=25对）和验证样本（N=98对）。在进行差异蛋白筛选时,同一组中每5个样本混合为1个样本,混合后病例组和对照组各5个样本,采用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（Isobaritags for relative and absolute quantification,i TRAQ）方法筛选血浆差异蛋白;验证差异蛋白时,随机挑选了10对筛选样本和另外的88对样本进行多反应监测模型（Multiple reaction monitoring,MRM）相对定量检测验证血浆内差异蛋白。采用t检验计算蛋白质积分峰面积的组间差异,采用受试者工作特征曲线（Receiveoperating characteristic curve,ROC）及曲线下面积（Area under the curve,AUC）分析血浆差异蛋白对糖尿病的判定能力。结果:采用i TRAQ方法共鉴定出815个蛋白质,其中35个蛋白质为mi R-193b-3p预测的靶基因编码蛋白质,通过肽段覆盖率（>50%）,变化倍数（Fold Change）（>1.2或<0.83）及差异比较P值（<0.05）,最终选择了磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase,TPI1）、前纤维蛋白（Profilin-1,PFN1）、髁蛋白（Talin-1,TLN1）和毛状蛋白（Coactosin-like protein,COTL1）共四个蛋白质通过MRM方法进行进一步验证。在糖尿病患者血浆中,TPI1的含量显著降低（Fold Change=0.73,P<0.001）,未发现其他三个蛋白质在两组中存在显著差异。采用受试者工作特征曲线评估血浆TPI1诊断糖尿病的能力,ROC曲线下面积为0.654（95%CI:0.577-0.731）。在logistic回归模型中纳入包括年龄、性别、吸烟、饮酒状况、BMI、总胆固醇水平和甘油三酯水平等传统危险因素,AUC为0.74,在此模型基础上纳入差异蛋白TPI1后,AUC提高至0.786（95%CI:0.721-0.851;P=0.04）。结论:本部分研究发现了细胞糖酵解过程中关键酶TPI1血浆水平在糖尿病患者中显著低于健康对照,同时TPI1也是数据库预测的血浆差异表达mi R-193b-3p的靶基因,提示mi R-193b-3p可能通过TPI1影响细胞中以糖酵解途径为代表的糖代谢过程。第三部分mi R-193b-3p过表达对于Hep G2细胞糖代谢功能的影响目的:前期生物信息学分析结果显示mi R-193b-3p可靶向作用于TPI1及PI3K-Akt信号通路上多个与糖代谢有关的因子。本部分将通过体外实验研究mi R-193b-3p对TPI1和PI3K-Akt通路中因子的靶向作用及对细胞内糖代谢功能的影响。方法:在Hep G2细胞系中转染mi R-193b-3p模拟物（mimic）和反义核酸抑制物（inhibitor）并建立各自的阴性对照,利用细胞增殖毒性检测（CCK-8）试剂盒检测转染后细胞活力,分别采用硫酸蒽酮法和葡萄糖氧化酶法测定细胞内糖原含量和细胞培养基内葡萄糖含量,乳酸检测试剂盒测定细胞培养基内乳酸含量,通过q RT-PCR和Western Blot方法验证mi R-193b-3p对数据库预测靶基因的靶向作用。细胞实验结果采用配对t检验或Wilcoxon秩和检验进行组间差异比较。结果:Hep G2细胞转染50nm mi R-193b-3p模拟物后（Mimic）,细胞内mi R-193b-3p表达量显著提高。与其他组相比,mimic处理组的TPI1在m RNA水平和蛋白质水平均显著降低（P<0.01）,未观察到细胞各处理组间乳酸释放量的差异。mi R-193b-3p过表达时,细胞PI3K-Akt信号通路细胞因子SOS Ras/Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子2（SOS Ras/Rho guanine nucleotide exchange factor 2,SOS2）和酪氨酸3-单氧合酶/色氨酸5-单氧合酶激活蛋白zeta（Tyrosine3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta,YWHAZ/14-3-3ζ）的m RNA和蛋白质水平显著降低,其下游的糖异生途径关键因子叉头转录因子（Forkhead box O1,FOXO1）和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK1）在蛋白质水平表达量显著升高（P<0.01）。在细胞转染48h后,更换细胞培养液为无血清培养基后培养12h,无糖培养基培养4h,并测定细胞培养基中的葡萄糖水平。结果表明,过表达mi R-193b-3p细胞培养基中葡萄糖水平显著高于mimic阴性对照组和inhibitor处理组（P值分别为0.016和0.04）。细胞转染48h后,过表达mi R-193b-3p细胞内糖原含量（P=0.0317）和糖消耗量（P=0.0043）均显著低于inhibitor处理组细胞,且胰岛素受体（Insulin receptor,IR）及葡萄糖转运体（Glucose transporter,member 2,GLUT2）的蛋白质水平显著低于其他组。结论:HepG2细胞内过表达mi R-193b-3p后,抑制了细胞内糖酵解酶TPI1及PI3K-Akt信号通路因子SOS2和YWHAZ/14-3-3ζ的表达,使转录因子FOXO1表达量显著升高,其下游的糖异生关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）表达量也随之增加,促进了细胞内葡萄糖产生。除此之外,mi R-193b-3p高表达也抑制了葡萄糖转运体（GLUT2）的表达,减少了细胞葡萄糖的摄取。