论文部分内容阅读
心血管疾病是威胁人类生命健康的重大疾病，随着社会进步和人民生活水平提高，其发病率逐年增长。而心肌缺血性疾病又是心血管疾病中的焦点，并可发展为心律失常、心肌梗死。因而如何切实有效地减轻因心肌缺血引起的损伤已成为当今医学界面临的一个热点问题。冠脉结扎法是最常用的建立急性心肌缺血模型的方法，广泛应用于心肌缺血损伤机制的研究。Langendorff离体心脏灌注稳定性好，重复性强，操作方便，是心血管研究领域中最为广泛使用的实验模型之一。可以单独对心脏进行研究，也排除了神经体液系统对实验过程的干扰。20世纪90年代，继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后发现了第三种气体信号分子硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）。内源性H2S在哺乳动物组织中广泛存在，参与了重要的生理和病理过程，且与多种心血管疾病有关。研究表明，H2S可拮抗心肌缺血再灌注损伤，具有心血管保护效应。但对急性心肌缺血损伤的影响报道较少，其机制尚不明确。本研究采用冠脉结扎法及Langendorff灌流系统复制离体大鼠急性心肌缺血损伤模型，观察H2S对急性心肌缺血损伤的影响，并从炎性细胞因子、细胞凋亡、氧化应激等方面探讨其可能的作用机制。第一部分离体急性缺血心肌内源性硫化氢和胱硫醚-γ-裂解酶的变化目的：观察急性心肌缺血过程中不同时间内源性H2S和CSE的变化。方法：应用Langendorff离体心脏灌注系统建立急性心肌缺血损伤模型。健康雄性SD大鼠160只，体质量（270±20g），随机分为假手术组，缺血30min组，缺血1h组，缺血2h组，缺血3h组，缺血4h组。假手术组80只（每个时间点16只），其余每组16只。缺血组结扎左冠状动脉前降支，假手术组只穿线但不结扎。分别于术后30min、1h、2h、3h、4h取材。取材前应用Powerlab/8s多导生理仪记录各组大鼠左室发展压（LVDP）、左室压力变化速率（±dp/dtmax）；测定冠脉流量（CF）；检测心肌组织中H2S含量及CSE活性；以Evan′s蓝和TTC双染法检测心肌梗死体积。结果：1各组间血流动力学指标在灌流平衡期间无明显差异，与相应假手术组大鼠比较，缺血30min、1h、2h、3h、4h组大鼠LVDP、±dp/dtmax、CF明显降低（P<0.01）。2假手术组大鼠心肌组织中H2S含量和CSE活性在灌流平衡后30min～4h之间无明显变化。与相应假手术组大鼠比较，缺血30min时大鼠心肌组织中H2S含量和CSE活性无明显变化，但随着缺血时间的延长，缺血1h、2h、3h、4h组大鼠心肌组织H2S含量和CSE活性均明显降低（P<0.05或P<0.01）。3与相应假手术组大鼠比较，缺血30min时大鼠心肌组织无明显梗死灶，缺血1h时可见明显梗死灶（P<0.01），随着缺血时间的延长，缺血2h、3h、4h时梗死体积明显增大（P<0.01）。结论：心肌缺血2h后，随缺血时间延长，心肌组织中H2S含量和CSE活性明显降低，心肌组织梗死体积逐渐增大，提示H2S与CSE参与了离体大鼠急性心肌缺血损伤。第二部分硫化氢对离体急性缺血损伤大鼠心肌的影响目的：观察H2S对急性心肌缺血损伤大鼠心脏功能，心肌组织H2S/CSE及心肌梗死体积的影响。方法：应用Langendorff离体心脏灌注系统建立急性心肌缺血损伤模型。健康雄性SD大鼠80只，体质量（270±20g），随机分为假手术组，模型组，硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组，每组16只。模型组结扎左冠状动脉前降支。假手术组只穿线但不结扎。硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组分别于心肌急性缺血2h时更换为5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分别于缺血后4h取材。取材前应用Powerlab/8s多导生理仪记录各组大鼠左室发展压（LVDP）、左室压力变化速率（±dp/dtmax）；测定冠脉流量（CF）；检测心肌组织中H2S含量及CSE活性；以Evan′s蓝和TTC双染法检测心肌梗死体积。结果：1与假手术组比较，模型组大鼠心功能指标LVDP、±dp/dtmax、CF明显降低（P<0.01）。与模型组比较，NaHS低、中、高剂量组大鼠心功能指标LVDP、±dp/dtmax、CF明显升高（P<0.05或P<0.01）。2与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中H2S含量和CSE活性降低（P<0.01）；与模型组比较，NaHS低、中、高剂量组大鼠两项指标均升高（P<0.05或P<0.01）。3与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死明显（P<0.01）；与模型组比较，NaHS中、高剂量组大鼠心肌梗死体积明显减小（P<0.01）。结论：NaHS可增强急性心肌缺血损伤心肌CSE活性，增加H2S含量，使心肌梗死体积缩小，提示H2S可改善急性心肌缺血损伤。第三部分硫化氢对离体急性缺血损伤大鼠心肌组织氧化应激的影响目的：观察H2S对急性心肌缺血损伤大鼠心肌氧化应激的影响，并探讨其作用机制。方法：应用Langendorff离体心脏灌注系统建立急性心肌缺血损伤模型。健康雄性SD大鼠40只，体质量（270±20g），随机分为假手术组，模型组，硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组，每组8只。模型组结扎左冠状动脉前降支。假手术组只穿线但不结扎。硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组分别于心肌急性缺血2h时更换为5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分别于缺血后4h取材。分光光度法测定心肌组织中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）活性；冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）活性；透射电镜观察心肌细胞超微结构变化。结果：1灌流平衡期间各组冠脉流出液中LDH活性无明显差异。与假手术组比较，模型组冠脉流出液中LDH活性增高（P<0.01）；与模型组比较，NaHS低、中、高剂量组冠脉流出液中LDH活性减低（P<0.01）。2与假手术组比较，缺血模型组心肌组织MDA含量明显升高，SOD和GSH-PX活性明显降低（P<0.01）。与模型组比较，NaHS低、中、高剂量组心肌组织MDA含量降低，SOD和GSH-PX活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。3假手术组大鼠心肌细胞结构正常，心肌纤维排列整齐，嵴清晰，无水肿、空泡化；模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，线粒体大量肿胀变形，嵴数量明显减少，断裂、溶解成空泡状，细胞核内染色体核边聚；与模型组相比，NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌细胞肌丝、胞核、线粒体等的病变程度较轻。结论：NaHS可使急性心肌缺血损伤时心肌细胞线粒体、胞核、肌丝等的病变程度减轻。冠脉流出液中LDH浓度降低，心肌组织MDA的生成减少，SOD和GSH-PX活性增强，心肌缺血损伤减轻。提示抗氧化应激是H2S减轻心肌缺血损伤的重要机制之一。第四部分硫化氢对离体急性缺血损伤大鼠心肌组织炎性细胞因子的影响目的：观察H2S对急性心肌缺血损伤大鼠心肌组织核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）等炎性细胞因子表达的影响，从炎性细胞因子方面探讨H2S对急性心肌缺血损伤的作用及可能的机制。方法：应用Langendorff离体心脏灌注系统建立急性心肌缺血损伤模型。健康雄性SD大鼠40只，体质量（270±20g），随机分为假手术组，模型组，硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组，每组8只。模型组结扎左冠状动脉前降支。假手术组只穿线但不结扎。硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组分别于心肌急性缺血2h时更换为5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分别于缺血后4h取材。实时荧光定量PCR（real timeRT-PCR）测定心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1mRNA表达；Western blot印迹法半定量测定心肌组织中NF-κB的表达。结果：1与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1mRNA表达显著增强，IL-10mRNA表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1mRNA表达明显降低，NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织中IL-10mRNA表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。2假手术组大鼠心肌组织中NF-κB表达较低，与假手术组比较，模型组大鼠NF-κB表达显著增加（P<0.01）；与模型组比较，NaHS中、高剂量组大鼠NF-κB的表达明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：NaHS可抑制急性心肌缺血损伤心肌NF-κB的活化，下调TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1的表达，上调IL-10的表达，通过抑制炎症反应而减轻心肌缺血损伤。第五部分硫化氢对离体急性缺血损伤大鼠心肌组织细胞凋亡的影响目的：观察H2S对急性心肌缺血损伤大鼠心肌组织细胞凋亡的影响，从细胞凋亡方面探讨H2S对急性心肌缺血损伤的作用及可能的机制。方法：应用Langendorff离体心脏灌注系统建立急性心肌缺血损伤模型。健康雄性SD大鼠40只，体质量（270±20g），随机分为假手术组，模型组，硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组，每组8只。模型组结扎左冠状动脉前降支。假手术组只穿线但不结扎。硫氢化钠（NaHS）低、中、高剂量组分别于心肌急性缺血2h时更换为5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分别于缺血后4h取材。采用HE染色法观察心肌组织形态学变化；末端缺口标记技术（TUNEL）检测心肌细胞凋亡率；Westernblot印迹法半定量测定心肌组织中Caspase-3和Cyt-c的表达。结果：1假手术组大鼠心肌组织结构正常，心肌肌原纤维排列整齐，无变性坏死等改变；模型组大鼠心肌内发生较大范围局灶性病变，出现明显变性坏死，心肌纤维呈长波浪形，排列紊乱、断裂；NaHS低、中、高剂量组心肌病变的程度明显减轻。2假手术组大鼠心肌细胞发生凋亡水平很低，模型组大鼠凋亡率明显高于假手术组（P<0.01），NaHS中、高剂量组心肌细胞凋亡率明显低于模型组（P<0.01）。3与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Caspase-3和Cyt-c蛋白表达明显增强（P<0.01）。与模型组比较，NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达明显降低（P<0.05或P<0.01）；NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织Cyt-c蛋白表达明显减少（P<0.05或P<0.01）。结论：NaHS可使急性心肌缺血损伤心肌细胞凋亡率降低，Cyt-c释放抑制，Caspase-3的表达减少。提示H2S可通过抑制心肌缺血后细胞凋亡而减轻心肌缺血损伤。