背景人脐带来源的间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSC）因其来源广泛、无创伤、无伦理争议，含量丰富而成为间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）治疗的优势来源，可在细胞治疗、组织工程等领域发挥极大的医学价值。目前用来分离提取HUCMSC的方法主要有单酶（胶原酶、I胶原酶或IV型胶原酶）、双酶（胶原酶与胰酶）以及三酶（胶原酶、透明质酸酶与胰酶）。但是这些传统方法消化过程所需时间长，所获取的HUCMSC与脐带组织中所含HUCMSC的理论值相差甚远，造成时间与脐带组织的极大浪费，阻碍了MSCs的规模化制备培养。因此，对传统方法进行优化，实现HUCMSC的高效获取，将会大大促进HUCMSC广泛应用于临床治疗、组织工程、科学研究的进程。目的针对脐带的结构与组成成分，组合五种消化酶，提高对脐带组织的消化程度，实现HUCMSC分离提取方法的优化，探寻并建立一套简单、高效、细胞获取量大的HUCMSC分离方法。方法实验分为四组，以传统酶法（胰酶与II型胶原酶）为对照组，在此基础上，针对脐带结构分别逐一加入IV型胶原酶、透明质酸酶、DNase来对脐带组织进行消化，各实验组设不同作用时间组，比较不同分离方法、不同作用时间所获得细胞数量、细胞活性、原代贴壁细胞出现时间、融合时间及所获得HUCMSC的在第3代细胞在增殖能力、表面标记与多向分化能力方面的差别。结果各实验组间比较，在同一作用时间，随着酶的种类的增加，细胞产量、细胞活性表现出升高趋势，差异显著。同一实验组内比较，随着作用时间的增加细胞产量提高，在4～6h达到平台，随后细胞产量下降，差异意义显著；细胞活性在4h达到最大，随后呈下降趋势，差异具有统计学意义。其中Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase五酶联合作用于脐带组织，4h细胞计数达到最高12.47±0.16×106/cm（P＜0.01）；活性为75.00±5.07%（P＜0.01）；收获的混合细胞中CD105阳性率为41.1%；CD29阳性率为83.1%，均高于对照组；3.25±0.46d细胞贴壁（(P＜0.01）；6.25±0.46d细胞团融合（(P＜0.01）；伴随细胞的传代，形态逐渐均一，第三代细胞形态基本达到统一，呈梭形漩涡状生长；流式细胞仪鉴定，细胞高表达MSCs的特异性标记CD44,CD105,CD29,而低表达CD34；其中四酶实验组P3HUCMSCs的CD105阳性率为85.3%；CD29阳性率为97.6%；CD44阳性率为95.8%；阳性率均高于对照组，CD34%阳性率为2.6%，低于对照组。向脂肪细胞诱导4周后，油红O染色鉴定分化结果，可见细胞内大量脂滴；向成骨细胞诱导后，茜素红染色鉴定，肉眼可见阳性钙沉积。因此，五酶联合作用4h，在保证细胞高活性的前提下提高了细胞产量，缩短了原代细胞贴壁及融合时间缩短；培养获得的HUCMSC在增殖能力、表面标记及多向分化能力方面与传统方法相比无明显差别，为高效分离提取HUCMSC最优方案。结论该实验证明了Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase五酶联合消化脐带组织作用4h的方法缩短了分离细胞用时并显著提高了细胞产量、细胞活力以及细胞增殖能力，同时缩短原代细胞贴壁时间、融合时间。流式细胞仪检测细胞免疫学表型显示，该方法提取得到的原代细胞中MSCs比例，第三代MSCs细胞纯度较传统方法均有提高。因此，该方法是一种高效分离HUCMSCs的方法，可用来规模化提取培养HUCMSCs以满足科学实验、临床治疗的需求。