随着环境污染的加深,导致大气中臭氧空洞的形成与扩大,使得更多的紫外线穿透云层抵达地面,使人体皮肤等部位接收到更多的紫外线。而紫外线包括UVA和UVB可以促使人皮肤中黑色素细胞合成黑色素的能力加深,导致皮肤色素沉积失常,造成晒斑,影响面容状况,给患者带来一定的心理和精神压力。而现存的美白剂,如曲酸和熊果苷皆存在着不足之处,因而筛选出可以抑制黑色素合成的天然美白产品具有巨大的应用价值和经济价值。在本文中,我们以小鼠黑色素瘤细胞B16F10为细胞模型,初步筛选出可以抑制黑色素含量的天然植物单体——穿心莲内酯。然后检测了酪氨酸酶活性、酪氨酸酶家族与其上游因子小眼相关转录因子的转录和蛋白表达以及黑色素合成过程中的相关信号分子蛋白表达量来研究植物单体抑制黑色素含量的机制,发现穿心莲内酯可以可以通过抑制Akt的磷酸化抑制GSK3β的磷酸化,从而抑制β-catenin的入核,下调小眼相关转录因子的转录,最终降低了酪氨酸酶的活性和黑色素的生成。并在紫外线UVB照射诱导色素沉积的棕黄色豚鼠和人黑色素细胞(Human Epidermis Melanocyte, HEM)上验证了该植物单体可以抑制黑色素合成的效果。本论文具体可分为以下四个部分：第一部分是“抑制黑色素合成的天然药物单体的筛选”。以B16F10细胞为黑色素抑制因子的初筛模型,选择曲酸作为美白剂的阳性药物,采用无酚红的含有待测药物的DMEM培养基培养细胞,待黑色素从细胞中分泌出来抵达上清液时,通过检测其在490nmm下的吸光值,从而筛选出可以抑制上清液OD值的植物单体,并查阅文献,找到一种文献中极少有报导的植物单体——穿心莲内酯。第二部分是“穿心莲内酯抑制体外细胞黑色素合成的研究”。首先检测了穿心莲内酯对B16F10细胞和HEM细胞活性的影响,然后再检测其对两种细胞中黑色素含量的影响,结果表明穿心莲内酯可以在不影响细胞增殖的前提下,有效抑制B16F10细胞和HEM细胞的黑色素含量,且呈剂量依赖性。然后检测了穿心莲内酯对B16F10和HEM两种细胞胞内酪氨酸酶活性和两种分别来自于蘑菇与小鼠的酪氨酸酶活性的影响,表明穿心莲内酯会影响胞内酪氧酸酶活性而不改变酪氨酸酶的催化活性结构。再通过实时荧光定量Q-PCR和蛋白免疫印迹实验检测酪氨酸酶家族和小眼相关转录因子的转录水平和蛋白表达含量,结果说明穿心莲内酯可以有效抑制酪氨酸酶家族和小眼相关转录因子的基因转录和蛋白表达。因此,穿心莲内酯可以通过抑制小眼相关转录因子的基因转录降低小眼相关转录因子的蛋白表达,从而抑制其靶基因酪氨酸酶家族的基因转录和蛋白表达,最终降低酪氨酸酶活性和黑色素含量。第三部分是“穿心莲内酯抑制动物皮肤黑色素合成的研究”。采用婴儿理发器和电动剃须刀,使棕黄色豚鼠背部出现四块2cm*2cm大小的裸露区域。然后使豚鼠一次性照射剂量为2J/cm2的UVB,再涂抹膏霜,每天两次。待四块区域的皮肤颜色出现差异时,剃净背部毛发。然后进行拍照,再将皮肤制成皮肤切片后进行免疫组织化学实验。结果显示5% 穿心莲内酯可以有效降低棕黄色豚鼠皮肤中经紫外线照射诱导产生的色素沉着、黑色素颗粒含量和酪氨酸酶蛋白含量以及酪氨酸酶阳性细胞数目,且抑制效果与5%曲酸相差不大。因此,穿心莲内酯可以通过抑制酪氨酸酶蛋白含量,降低酪氨酸酶阳性细胞数目,抑制黑色素细胞分化,从而抑制黑色素的合成,最终抑制棕黄色豚鼠皮肤中经紫外线照射诱导的皮肤色素沉着。第四部分是“穿心莲内酯抑制黑色素合成的分子机制探讨”。通过蛋白免疫印迹实验,发现B16F10细胞经穿心莲内酯处理后,其胞内β-catenin蛋白含量、glycogen synthase kinase 3β (GSK3β)和Akt磷酸化水平显著下降,同时β-catenin的入核量明显降低。再通过MG132和放线菌酮实验,发现穿心莲内酯加快了β-catenin经蛋白酶体的降解过程。而GSK3β抑制剂可以抑制由穿心莲内酯导致的β-catenin的含量、酪氨酸酶的活性和黑色素的含量的减少。Akt激活剂可以抑制由穿心莲内酯导致的p-Akt, GSK3β, β-catenin含量的下降。因此,穿心莲内酯可以通过调控Akt磷酸化来减少GSK3β的失活,从而加速β-catenin降解,抑制β-catenin的入核,最终抑制了小眼相关转录因子的基因转录。