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作为感觉神经系统的一部分，耳蜗感受机械刺激，向中枢传递听觉信息。听觉信号的转导涉及耳蜗内离子浓度和蜗内电势自稳态的维持、内外毛细胞电兴奋性的维持、机械-电能转换、信号识别、调制和转导、听觉信息的初步编码和向中枢的传递等，而离子通道在这些过程中起到核心作用。 内毛细胞表达多种离子通道蛋白，其中α1DL-型电压门控性钙通道（CANA1D）位于突触前膜，控制内毛细胞钙离子内流和内耳传入突触的递质释放，与听觉信号的产生密切相关。 内毛细胞传入突触对听觉刺激信号传导的忠实性要求钙通道的动力学特性必须能够忠实的保持声音信号的相位特性和感受器电位的紧张性特性。哺乳动物的内毛细胞必须能够传递信号频率高达2kHz的实时声音信息，这么高的传递频率要求内毛细胞传入突触能够非常迅速的释放递质；另外，对应于连续数小时的声音刺激，内毛细胞可以进行持续的递质释放。 α1DL-型电压门控性钙通道在神经元和内分泌细胞也有表达，研究表明耳蜗内毛细胞记录到的钙流与上述组织表达的通道蛋白电生理特性不同：内毛细胞表达的钙通道具有极低的激活阈值（～-65mV，相当于内毛细胞的静息电位），迅速激活（τ=0.1-0.5ms）和去激活（Deactivation），几乎不表现出电压或Ca2+依赖性的失活现象，且对二氢吡啶类（Dihydropyridines, DHPs）的钙通道阻滞剂不敏感（10μM的尼福地平仅能阻断40％的钙流）。 迄今为止，从神经元和神经内分泌细胞克隆到的各种α1D剪切异构体在体外表达后均不能完全模拟耳蜗内毛细胞电压门控性钙通道蛋白的动力学特性，目前尚无内耳(α1D钙通道体外表达的研究报导。军医进修学院博士论文 中文摘要 显然a；。L型钙通道在这些组织中行使不同的功能，但导致同一基因在不同组织表达出如此功能不同的通道蛋白的机理有待研究，可变剪切…lternative splicing)可能是产生这种现象的主要机制。 与视觉、嗅觉及其它感觉神经元不同，内耳毛细胞深埋在骨壳内，现有检测手段难以接近，而且内耳感觉细胞数量有限，这些都限制了毛细胞的生化、细胞学、生理学等方面的研究。与其它感觉神经元相比，内耳毛细胞的研究，尤其是在细胞和分于水平上的研究明显滞后于其它感觉器官，研究材料取得的困难是主要的限制环节。 本研究中采用显微解剖技术取材，我们首次以大鼠耳蜗基底膜为起始材料，结合高灵敏度的RT－PCR扩增和基因克隆技术，研究了tlD L一型钙通道蛋白在大鼠耳蜗内表达的、具有组织特异性的剪切形式。通过序列分析发现，耳蜗表达的a山L一型钙通道的选择性剪切主要发生在通道蛋白的氨基末端。梭基末端和跨膜功能域I、H之间的连接区几＊p人 发生在氨基末端和功能域I、11之间的连接区剪切均为耳蜗组织特异性的，与从脑组织和胰腺p细胞克隆的… 钙通道的CDNA结构不同。而簸基末端的B、C两种剪切形式虽然为脑组织和耳蜗所共有，但这两种剪切类型在脑组织和耳蜗中的组织丰度不同，B型是脑组织最常见的剪切形式，C型是耳蜗最常见的剪切形式。 研究表明a；o钙通道蛋白的梭基末端和跨膜功能域I、11之间的、位于细胞内的连接区是a；亚单位与p亚单位相互作用的位置，而p亚单位对al离于通道的动力学特性和电压依赖的激活和失活特性具有重要的调控作用。据此我们推测，虽然与神经内分泌细胞一样，内毛细胞的QID电压门控性钙通道控制内耳传入突触递质的紧张性释放，但通过组织特异性的剪切机制，产生了耳蜗特异性的钙通道蛋白，这些新的剪切异构体通过与p亚单位的相 3军医进修学院博士论文 中文摘要互作用，使耳蜗组织表达的。；。钙通道获得了独特的门控特性，以适应内毛细胞传入突触快速、持续、紧张性递质释放的需求。 我们从耳蜗中克隆了两种具有完整开放读码框（Open readingfrlllTIC，ORF）的 (XI一型钙通道剪切异构体，提示耳蜗可能通过组织特异性的剪切机制，由同一个山。电压门控钙通道基因＊＊＊＊AID在耳蜗表达了两种结构和功能不同的通道蛋白，分别产生毛细胞上记录到的两种不同特性的钙流。 两种。1。钙通道剪切异构体具有不问的电压门控特性和药理学特性，可能在不同的膜电位水平激活，分别在静息时和声音刺激时开放，控制内毛细胞的自发性发放 （Spontaneou Disch啪e）和内毛细胞传入突触神经递质的紧张性释放。 同时，本研究还构建了真核细胞表达质粒 pCDNA3．1卜COChCACNAID，利用异源表达系统，在体外转染HEK293细胞，建立了大鼠耳蜗川。剪切异构体的稳态表达细胞系，报导基因的表达显示转染成功，RT干CR在转录水平证实al。的成功表达，为今后耳蜗表达a；。组织特异性钙通道剪切异构体的电生理学和药理学研究奠定了基础。