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本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 GFP-BDNF慢病毒转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元 研究背景： 阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是最为常见的中枢神经系统退行性疾病,以认知功能和日常生活能力下降为主要临床表现,可出现不同程度的精神行为症状,晚期可出现残疾及自主生活能力丧失,给患者、家庭和社会带来了沉重的负担,但目前尚缺乏有效的治疗手段.人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有自我更新、显著增殖及高分化潜力,可以向神经元、神经胶质细胞等分化,同时因还具有易分离、来源丰富、低免疫原性、免疫调节性、旁分泌作用、无致瘤性及有限的伦理问题等特性,广泛应用于细胞治疗.脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是大脑中最普遍的神经营养因子,对于神经元的存活和活动起重要作用,在体内外应用外源性BDNF可以增强MSCs对神经元保护作用,但BDNF转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元对胆碱能活性的影响目前尚不明确. 研究目的： 探讨GFP-BDNF慢病毒转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元对胆碱能活性的影响. 研究方法： 采用组织块法分离足月剖宫产新生儿脐带组织中的MSCs并传代培养,P3代hUC-MSCs定向诱导分化为胆碱能样神经元.采用免疫荧光鉴定诱导前后ChAT、Nestin的表达及ChAT和MAP-2的共表达情况.绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)-空载体慢病毒及GFP-BDNF慢病毒转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元,将实验分为四组:hUC-MSCs组、胆碱能样神经元组、胆碱能样神经元+空载体组、胆碱能样神经元+过表达BDNF载体组.通过免疫荧光鉴定GFP表达及观察ChAT和MAP-2共表达情况.采用Western blot检测各组细胞ChAT、Nestin、BDNF表达情况.并用乙酰胆碱试剂盒检测各组细胞上清液中乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)含量. 研究结果： 1.hUC-MSCs可向胆碱能样神经元诱导分化,免疫荧光显示,定向诱导后ChAT、Nestin表达较诱导前明显增多(P<0.01),诱导后双标ChAT和MAP-2共表达较诱导前明显增多. 2.免疫荧光鉴定各组GFP表达:结果显示,胆碱能样神经元+空载体组、胆碱能样神经元+过表达BDNF载体组均可见绿色荧光表达. 3.免疫荧光鉴定各组ChAT和MAP-2共表达:结果显示,胆碱能样神经元+过表达BDNF载体组的ChAT和MAP-2共表达较其它三组表达明显增多,胆碱能样神经元+空载体组及胆碱能样神经元组的ChAT和MAP-2共表达较hUC-MSCs组表达明显增多. 4.Western blot检测各组细胞ChAT、Nestin和BDNF表达:结果显示,胆碱能样神经元+过表达BDNF载体组的ChAT、Nestin、BDNF表达较其它三组表达明显增多(P<0.01),胆碱能样神经元+空载体组及胆碱能样神经元组的ChAT、Nestin、BDNF表达较hUC-MSCs组表达明显增多(P<0.05). 5.Ach含量测定:Ach试剂盒检测示,胆碱能样神经元+过表达BDNF载体组Ach含量较其它三组Ach含量明显增多(P<0.01),胆碱能样神经元+空载体组、胆碱能样神经元组Ach含量较hUC-MSCs组Ach含量明显增多(P<0.05). 研究结论： 1.hUC-MSCs可以向胆碱能样神经元定向诱导分化. 2.GFP-BDNF转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元后ChAT、Nestin的表达及ChAT和MAP-2共表达增多. 3.GFP-BDNF转染hUC-MSCs源性胆碱能样神经元可促进乙酰胆碱的分泌. 第二部分 BDNF修饰的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元移植对AD大鼠的治疗作用 研究背景： AD是与年龄相关的神经系统退行性疾病,是老年痴呆最常见类型,主要病理改变为老年斑、神经原纤维缠结以及神经元缺失.目前尚无治愈方法.hUC-MSCs是来源于人体脐带沃顿胶组织中的多能干细胞,具有多分化潜能,在特定环境下可诱导分化成胆碱能样神经元,并促进乙酰胆碱释放.同时,BDNF也可以促进神经发生和突触形成,减少氧化应激及细胞死亡.但BDNF修饰hUC-MSCs源性胆碱能样神经元在AD中的作用如何目前尚不清楚. 研究目的： 探讨BDNF修饰的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元移植在AD大鼠模型中的治疗作用. 研究方法： 将大鼠随机分为AD模型组和假手术组,向模型组大鼠海马区注射1μL Aβ1-42制备AD模型,假手术组大鼠海马区注射等量的生理盐水.收集hUC-MSCs源性胆碱能样神经元-空载体及hUC-MSCs源性胆碱能样神经元-过表达BDNF载体细胞分别缓慢注入AD大鼠海马中,将实验分为四组即假手术组、AD组、AD+胆碱能样神经元-空载体组、AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组.8周后行Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力变化,Western blot检测一侧海马组织中ChAT、AChE、BDNF、DCX的表达,免疫组织化学检测海马CA1、CA2、CA3和DG区Aβ和BACE1的表达情况.免疫荧光检测星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物Iba-1的表达以及TUNEL检测神经元凋亡情况. 研究结果： 1.Morris水迷宫实验显示,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组在定位航行实验中,逃避潜伏期相对AD+胆碱能样神经元-空载体组及AD组明显减少(P<0.01).在空间探索实验中,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组大鼠在目标象限的时间百分比及穿越平台次数显著高于AD+胆碱能样神经元-空载组及AD组(P<0.01). 2.Western blot检测显示,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组海马区脑组织ChAT、AChE、BDNF、DCX的表达较AD+胆碱能样神经元-空载体组及AD组显著增多(P<0.01). 3.免疫组织化学显示,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组海马区脑组织CA1、CA2、CA3、DG区Aβ、BACE1的表达较AD+胆碱能样神经元-空载体组及AD组明显减少(P<0.05). 4.免疫荧光染色显示,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组海马区GFAP、Iba-1的表达较AD+胆碱能样神经元-空载体组及AD组明显增多. 5.TUNEL检测神经元凋亡显示,AD+胆碱能样神经元-过表达BDNF载体组海马区脑组织神经元凋亡较AD+胆碱能样神经元-空载体组及AD组明显减少(P<0.01). 研究结论： 1.过表达BDNF的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元移植能够明显改善AD大鼠空间学习记忆能力. 2.过表达BDNF的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元组与hUC-MSCs源性胆碱能样神经元-空载体组、AD组相比,促进海马区乙酰胆碱的释放以及ChAT表达增多. 3.过表达BDNF的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元组与hUC-MSCs源性胆碱能样神经元-空载体组、AD组相比,明显改善星形胶质细胞和小胶质细胞的激活,减少淀粉样相关蛋白Aβ、BACE1表达 4.过表达BDNF的hUC-MSCs源性胆碱能样神经元组与hUC-MSCs源性胆碱能样神经元-空载体组、AD组相比,抑制神经元凋亡,促进神经发生以及突触相关蛋白表达增多.