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植物非特异性脂转移蛋白(nonspecific lipid transfer protein,nsLTP)是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白,编码nsLTP的基因在许多植物中都以基因家族的形式存在,如拟南芥、大麦等。nsLTP成员具有不同的生物学功能,主要涉及角质合成,用以调节脂质储藏的分解代谢的β氧化、体细胞胚胎形成、植物信号转导、参与植物有性生殖、花粉发育、对病原物的防御以及对生物和非生物胁迫的应答等。明确不同成员在植物抗性形成方面的作用,对于调控植物抗性和利用基因工程改良植物抗性有重要意义。本论文克隆得到了蜡梅脂转移基因家族4个成员,并进行了启动子分离工作,利用生物信息学、荧光定量PCR、原核表达等方法对获得的蜡梅脂转移蛋白基因家族成员抗逆性的差异进行了分析,主要结果如下:1蜡梅nsLTP基因家族4个成员的克隆与分子特征分析在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了4个编码蜡梅非特异性脂转移蛋白的基因(nsLTP),分别命名为CpLTP1,CpLTP2,CpLTP3和CpLTP4,GenBank登录号为FJ889521,FJ904082,FJ904083和FJ904084。它们的cDNA全长分别为611、1016、656和997 bp,ORF分别为360、360、351和660 bp,无内含子,5′和3′端的非翻译区的长度不等,存在的调控基序有所不同。运用生物信息学手段对蜡梅nsLTP基因家族4个成员编码蛋白CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3和CpLTP4的结构特点与性质进行了分析,CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3具有明显的植物脂转移蛋白nsLTPI类的特征,分子量都为9KD,含有保守的4个螺旋区、8个半胱氨酸位点和脂质结合基序,具有明显的信号肽序列,定位于细胞外的可能性最高,进一步的三级结构预测也显示能够形成管状的疏水腔。而CpLTP4与其他3个编码蛋白显著不同,具有较高的分子量(19.7KD),虽然同样具有8个保守的半胱氨酸位点,但第8个位点的位置与nsLTPI类有一定的差异,细胞定位有所不同,定位于质膜的可能性最高,三级结构预测显示形成上宽下窄的类似于三角形的疏水腔,聚类分析时与同样高分子量的刚毛怪柳、蓖麻等的脂转移蛋白聚在一支,这种高分子量的脂转移蛋白有可能形成一个新的类别。2蜡梅nsLTP基因家族4个成员的原核表达及其产物抑菌活性分析成功构建LTP1-pET、LTP2-pET、LTP3-pET、LTP4-pET原核表达载体,转化Origami(DE3)表达菌株,通过诱导条件优化,在28℃、0.5m MIPTG、诱导6h能够获得较好的可溶性表达。利用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒获得4个纯化的重组蛋白。体外抑菌试验结果表明,4个重组蛋白都具有抑菌活性但有差异,其中LTP4重组蛋白抑制小麦赤霉菌生长的能力最强,LTP1最弱。对于细菌的抑制活性还有待进一步试验验证。3蜡梅nsLTP基因家族4个成员非生物胁迫表达的荧光定量分析对蜡梅植株进行低温、干旱、高盐和ABA诱导处理,利用荧光定量PCR技术分析蜡梅nsLTP基因家族4个成员在蜡梅叶片中的表达情况,结果表明,4个nsLTP基因在蜡梅幼苗中的表达受干早、ABA、低温和NaCl处理的影响程度不同。CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3基因在胁迫处理下表达总体下调,而CpLTP4基因在胁迫处理下表达总体上调,其中在低温处理下表达量最高。结果表明虽然CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3基因来自于同一基因家族,但其功能上具有明显的差异,可能在蜡梅幼苗的水分平衡、耐受低温、离子代谢等过程中发挥着不同的作用,CpLTP4基因可能对蜡梅抵抗非生物胁迫起更重要的作用。4蜡梅CpLTP3、CpLTP4基因启动子的克隆及瞬时表达分析利用hiTAIL-PCR法分离分别得到了CpLTP3、CpLTP4基因5′端上游的一段长1298bp和838bp的序列,二者的序列差异较大,Identity值为27.75%。经序列测定及软件分析表明,这两个序列具有典型的启动子结构,除含有TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件,另外都含有较多的光应答元件、与植物非生物胁迫相关的一些响应元件,如ABRE、G-BOX、HSE。仅在CpLTP4pro发现GARE-motif、TATC-box、MBS、TC-rich repeats,在CpLTP3pro启动子发现与细胞周期调控有关的顺式调控元件MSA-like和胚乳表达必须的顺式调控元件Skn-1_motif。将克隆得到的蜡梅启动子CpLTP3pro、CpLTP4pro代替pBI121中的CaMV35S启动子构建成适于瞬时表达研究的植物表达载体pB1121-CpLTP3pro和pBI121-CpLTP4pro。通过农杆菌介导的瞬时表达研究,在GA3诱导下,CpLTP4pro能够驱动GUS基因在烟草叶片中的表达,而CpLTP3pro不能。在CpLTP3pro、CpLTP4pro驱动下,GUS基因在烟草叶片中的表达都受ABA、Nacl、PEG、4℃、37℃等处理诱导。表明蜡梅启动子CpLTP3pro、CpLTP4pro具有作为胁迫诱导驱动目标基因表达的潜力。论文研究结果表明,蜡梅nsLTP基因家族4个成员CpLTP1,CpLTP2,CpLTP3和CpLTP4的抗逆性存在差异,CpLTP4可能与蜡梅抗逆性的关系最为密切。为了进一步鉴别蜡梅nsLTP基因家族成员的抗逆性差异,尚需克隆蜡梅nsLTP基因家族其他成员及启动子,并利用转基因等技术对编码蛋白的抗逆性和启动子活性的诱导差异性进行深入研究才能完成。