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第一部分CPI-1205协同6-MP抑制B-ALL细胞生长目的:肿瘤化疗药物中的6-巯基嘌呤（6-Mercaptopurine,6-MP）通过HPRT（Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyltransferase）代谢为6-TGN（6-Thioguanine Nucleotide）,或通过TPMP（Thiopurine Methyltransferase）代谢为6-MMP（6-Methyl-mercaptopurine）,干扰嘌呤合成。同时,6-MMP易致严重毒副作用。因甲基化/去甲基化调节基因表达,甲基化抑制剂5-氮杂胞苷能重新激活因启动子区甲基化而表达抑制的HPRT基因。此外,甲基化转移酶与TPMP共用甲基供体SAM（S-Adenosylmethionine）。故,为降低6-MP使用剂量,减轻其毒副作用,拟寻找协同6-MP抑制急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞生长的甲基化抑制剂,并探讨两种药物的有效浓度及联合用药比例。方法:通过Drug BANK数据库结合Clinical Trail注册信息,筛选4种甲基化小分子抑制剂。CCK-8检测与分析不同药物浓度、联合用药方案对B-ALL细胞生长抑制作用;利用Graph Prism、Calcusyn软件计算半数抑制浓度（IC50）及药物联合指数（CI）。结果:0.01n M-100μM 6-MP作用于B-ALL细胞株:Sup-B15、Reh、HAL-01及Bal01,IC50浓度分别为:2μM、1μM、1.5μM及138μM。但,Drug Central 2021分析儿童常用化疗药物,与其它化疗药物相比,6-MP血细胞毒性及复发率均较高。另一方面,通过Drug BANK数据库结合Clinical Trail筛选甲基化抑制剂CPI-1205、Decitabine、Temozolomide及Zebu Larine。0.01n M-100μM甲基化抑制剂作用于B-ALL细胞株,发现:CPI-1205抑制Sup-B15、Reh、HAL-01细胞株生长,IC50均约为50μM;Temozolomide抑制Sup-B15、HAL-01细胞株生长,IC50均约为70μM;其余均无效或IC50＞100μM。进一步,2μM、1μM 6-MP分别作用于Sup-B15、Reh细胞株,转录组测序,分析发现:6-MP干预后RNA组改变与甲基化干预后RNA组改变类似。故,为探索6-MP与CPI-1205联合抑制B-ALL的可能,10n M-1μM 6-MP与60μM CPI-1205联用并发现:10n M-600n M 6-MP联合60μM CPI-1205作用Sup-B15、Reh,生长抑制率均＞50%。但,6-MP与CPI-1205浓度比仅在100:1、200:1时分别在Sup-B15、Reh中具有良好浓度线性相关性。在最适药物浓度比例中,300n M 6-MP联合30μM CPI-1205可致Sup-B15达IC50;150n M 6-MP联合30μM CPI-1205可致Reh细胞达IC50。此外,30μM CPI-1205与300n M 6-MP联合使用,48小时二次给药,能抑制部分B-ALL细胞生长（3/8）;同时,30μM CPI-1205与300n M 6-MP联合对非白血病患者外周血分离的单核细胞生长抑制作用比单独使用30μM CPI-1205或300n M 6-MP时抑制作用低。结论:30μM CPI-1205协同0.3μM/0.15μM 6-MP抑制Sup-B15/Reh细胞生长;30μM CPI-1205联合0.3μM 6-MP,48小时二次给药抑制部分B-ALL肿瘤细胞生长,且对非白血病病人外周血单核细胞生长抑制作用比0.3μM 6-MP作用时低。第二部分CPI-1205联合6-MP促进B-ALL细胞凋亡目的:CPI-1205联合6-MP有效抑制B-ALL细胞生长基础上,探讨联合用药后对抑制EZH2酶活性、6-MP胞内转运的影响,及细胞功能改变。方法:Edu、Ki67试验检测细胞增殖;流式细胞术PI染色检测细胞周期;流式细胞术及DAPI染色检测细胞不同时间点凋亡;酶联免疫检测H3K27甲基化转移酶总活性及比色法检测H3K27me3水平;高效液相色谱技术检测胞内6-MP浓度。结果:30μM CPI-1205联合0.3μM/0.15μM 6-MP作用于Sup-B15/Reh细胞,48小时后对细胞功能进行检测,发现:与6-MP相比,CPI-1205联合6-MP能有效抑制Sup-B15及Reh细胞增殖;Sup-B15细胞中G0/G1期细胞比例降低,而G2/M期细胞比例增高,但Reh细胞中G0/G1及G2/M期细胞比例均增高,S期细胞比例降低;药物作用24小时（Sup-B15 3.88±0.21 vs 6.47±0.56,Reh 8.51±4.08 vs 11.2±4.89）、48小时（Sup-B15 3.05±1.27 vs 3.27±1.56,Reh 6.49±2.27 vs 8.79±3.62）后凋亡细胞比例均明显增高。进一步在Sup-B15细胞中研究发现,与CPI-1205单独处理组比,CPI-1205联合6-MP处理组对H3K27甲基化转移酶总活性及H3K27me3水平几乎无影响;与6-MP单独处理组相比,CPI-1205联合6-MP处理组6-MP胞内浓度上升约3倍。结论:与6-MP处理组相比,CPI-1205联合6-MP抑制B-ALL细胞增殖、促进凋亡;对H3K27甲基化转移酶总活性及H3K27me3水平无影响,提高胞内6-MP浓度。第三部分CPI-1205协同6-MP促进B-ALL细胞凋亡的机制目的:初步探讨CPI-1205协同6-MP促进B-ALL细胞凋亡及胞内6-MP浓度增加的分子机制。方法:RNA-Seq检测并分析药物干预Sup-B15和Reh细胞后基因表达和信号通路改变。Q-PCR,WB,Confocal及GSE数据分析并鉴定基因改变。构建并鉴定TRIB3、SLC43A3敲低的稳定细胞株SUP-B15（Si-TRIB3-Sup,Si-SLC43A3-Sup）;CCK-8、凋亡检测TRIB3、SLC43A3敲减对细胞功能的改变;30μM CPI-1205、0.3μM 6-MP、30μM CPI-1205联合0.3μM 6-MP处理Si-TRIB3-Sup,Si-SLC43A3-Sup细胞株,分析TRIB3、SLC43A3基因对药物干预的影响。String、Cytoscape模拟TRIB3及SLC43A3可能关系,并Q-PCR验证。结果:与6-MP处理组相比,RNA-Seq数据经过滤、差异基因功能富集发现:CPI-1205联合6-MP处理组中凋亡相关通路被富集于Top20中,且15个凋亡通路相关基因均高表达。检测不同时间点、不同药物浓度作用Sup-B15细胞后ATF4、TRIB3及CASP4等凋亡相关基因m RNA水平,发现:与0.3μM 6-MP处理组相比,30μM CPI-1205联合0.3μM 6-MP作用Sup-B15细胞48小时后TRIB3 m RNA水平明显升高、随作用时间递增,TRIB3蛋白水平升高至约2倍。此外,GSE61905数据库分析发现:与巯基嘌呤耐药细胞株相比,巯基嘌呤敏感细胞株高表达TRIB3。Sup-B15细胞敲减TRIB3基因后,促细胞生长、抑制其凋亡。CPI-1205联合6-MP处理Si-TRIB3-Sup细胞,Si-TRIB3-Sup细胞生长被抑制,但抑制率比Sup-B15低。另一方面,GSE61905数据分析发现:与巯嘌呤耐药的细胞株相比,对巯嘌呤敏感的细胞株中SLC43A3高表达;CPI-1205联合6-MP作用Sup-B15,SLC43A3 m RNA水平及膜蛋白水平均比6-MP处理组高。敲减SLC43A3基因后,Si-SLC43A3-Sup细胞生长率更高、凋亡水平降低,CPI-1205联合6-MP抑制Si-SLC43A3-Sup细胞生长,但抑制率比Sup-B15低。String、Cytoscape构建转运子与凋亡相关基因信号通路图,SLC43A3调控多条凋亡相关通路包括:TRIB3,Q-PCR验证SLC43A3敲低后TRIB3 m RNA水平降低。结论:与6-MP组相比,CPI-1205联合6-MP提高TRIB3、SLC43A3表达水平,从而促进48小时凋亡率;受损表达的SLC43A3降低TRIB3m RNA水平。第四部分CPI-1205协同6-MP延缓B-ALL白血病小鼠进程目的:探讨CPI-1205联合6-MP在B-ALL小鼠模型中有效性。方法:30μM CPI-1205、0.3μM 6-MP、30μM CPI-1205联合0.3μM6-MP及对照DMSO干预48小时后的Sup-B15细胞、未经药物干预Sup-B15细胞,尾静脉注入NOD/SCID小鼠体内构建白血病小鼠模型;将B-ALL细胞用药换算成小鼠体内用药浓度,腹腔注射不同浓度的CPI-1205（25.92mg/kg、12.96mg/kg、6.48mg/kg、3.24mg/kg,对应稀释后药物的注射体积分别为VμL、1/2VμL、1/4VμL、1/8VμL）、6-MP（8.509mg/kg、4.254mg/kg、2.127mg/kg,对应稀释后药物注射体积分别为VμL、1/2VμL、1/4VμL）,1天/次或2天/次,共5次;利用流式细胞术及骨髓涂片动态监测成瘤,记录生存时间、收集组织样本、H＆E染色评估组织浸润程度。结果:CPI-1205、6-MP、CPI-1205联合6-MP干预后的Sup-B15构建的白血病小鼠,33天时CPI-1205联合6-MP干预组h CD45+细胞比例更低;终末期骨髓幼稚细胞数更少;比较OS,DMSO组＜未经处理细胞组（28.33±3.66天vs 38.00±1.57天）,但与DMSO组相比,CPI-1205（33.33±5.12天）、6-MP（39.33±7.11天）、CPI-1205联合6-MP（41.83±5.67天）干预组OS均比其长;CPI-1205联合6-MP组肝脾浸润程度最低。对未经干预的Sup-B15细胞构建的白细胞小鼠腹腔药物干预,第33天时,各组小鼠均有死亡,尤其1/2V CPI-1205干预组及1/4V 6-MP干预组,死亡率均为66.67%（2/3）;骨髓幼稚细胞数无明显差异。腹腔注射CPI-1205 V、1/2V、1/4V、1/8V组间OS无明显差异,1/4V（即6.48mg/kg）与1/8V（即3.24mg/kg）组OS相对较长,1/8V组组织浸润程度更低;腹腔注射6-MP,1/2V（即4.254mg/kg）组OS明显优于V、1/4V组,且组织浸润程度最低。结论:与单独使用6-MP相比,CPI-1205联合6-MP干预后的Sup-B15构建的B-ALL白血病小鼠的进程被延迟;CPI-1205、6-MP治疗Sup-B15来源白血病小鼠的有效浓度分别为:3.24mg/kg、4.254mg/kg。