背景与目的:随着生命科学的研究进展,“生物钟”的研究成为近年生命科学研究的热点。国际权威杂志(Science)认为“生物钟的研究可能改变人类对自然的认识,从而产生重大社会和经济效益、有重大突破的研究领域”。将生物钟的理论引入疾病的治疗中则形成时间治疗学(Chronotherapy),且在许多疾病的治疗中具有独特优势,尤其在肿瘤的化疗方面。鉴于化疗药物的毒性及有效性是矛盾的两个方面,许多学者正试图通过基因靶向等方法来减少毒性、提高疗效,但目前仍处于临床探索阶段,尚未发现有更好的方法来达到此目的,故时辰化疗有可能在这方面有所突破。目前在世界范围内,已经开展了在基础、临床等方面的研究,并已经取得初步成果,目前大部分化疗药物已经具备了时辰化疗方面的基础和临床研究数据,选择“健择”作为本实验化疗药物,目的在于目前它在临床治疗卵巢癌上作为二线药化疗。它作为细胞周期特异性抗代谢类药物,主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞,即S期细胞,在一定条件下,可阻止G1期向S期的进展;对各种培养的人及鼠肿瘤有明显的细胞毒性,且健择与时间药理学有关的实验数据尚未见国内文献报道。本实验采用检测和选用ER,PR受体阳性率达50%的卵巢癌细胞株作为实验材料,是因为此类细胞生物特性更接近人的卵巢癌细胞。而且可以在小鼠体内时辰化疗的研究基础上,进一步研究在没有下丘脑-视上核对光调控的体外卵巢癌细胞株对化疗药物是否有昼夜变化。国外仅有少数报道关于化疗药物在体外对癌细胞株作用24小时昼夜节律,国内尚无类似研究,且本实验研究化疗药物在体外对癌细胞株作用48小时节律,这样结果将更可靠。从而为临床制定这种药的时辰化疗方案提供必要的实验依据。方法第一部分用单克隆抗体免疫组化两步法:测定体外培养卵巢癌细胞株SKOV3,H08910,A2780ER、PR浓度,采用鼠抗人单克隆抗体EstrogenReceptor,该抗体为识别分子量67kDa的雌激素抗体。鼠抗人单克隆Progesterone Receptor该抗体特异性识别人孕激素受体。免疫组化染色二步法,按照说明书步骤进行。切片由ER、PR的染色均定位于肿瘤细胞浆与细胞核中。采用免疫组织化学积分即Hscore积分法进行结果判定。染色结果综合染色强度和染色范围进行半定量处理。阳性细胞标准:(1)结构清晰;(2)着色明显区别于背景,Hseore=gvi(i+1),i为染色强度。所有染色玻片确保相近的实验条件。i根据以下标准分为Ⅳ级:0为阴性;(+)染色弱,但明显高于阴性对照;(++)染色清晰;(+++)染色强。+、++、+++3个染色强度分别用i-1,2,3表示。i=0时,染色阴性,积分为0,Pi为每一染色强度范围内阳性癌细胞数占切片所有癌细胞的百分值。这样将切片中所有阳性癌细胞染色强度及其百分数转化为相应的数值并累加起来,达到对ER、PR染色半定量的目的。确定Hseore≥75为阳性,Hseore<75为阴性。第二部分1.用MTT法检测健择对三种卵巢癌细胞的IC50计算:将三种细胞制成×10~4个细胞/ml悬液,种植于96孔培养板内,每孔100ul。试验设十五种不同浓度健择(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml,400ug/ml,600ug/ml,800ug/ml,1000ug/ml,2000ug/ml,3000ug/ml,4000ug/ml,5000ug/ml,6000ug/ml,7000ug/ml,8000ug/ml,10000ug/ml)的试验组(每孔加用药100u1)及试剂对照组,按公式抑制率=1一试验组平均值/对照组平均值计算各种药物浓度的抑制率及中效浓度(IC50),试验重复3次取平均值2.将受体阴阳性细胞作为对照组制成1×10~4个细胞/ml悬液,种植于96孔酶联反应培养板内,每孔100ul,再用各个细胞健择IC50浓度按12个时点连续48小时0:00,04:00,08:00,12:00,16:00,20:00,0:00,04;00,08:00,12:00,16:00,20;00培养24小时,在倒置显微镜下可见细胞已覆盖孔底50-60%加药进行实验,再培养24小时后,继续加药连续48小时后,用MTT法检测细胞的各时辰点抑制率,结果经SPSS检验P值,它们的差别具有统计学意义。结果(1)卵巢癌细胞A2780ER(+),卵巢癌细胞株A2780PR(－),卵巢癌细胞SKOV3ER(－),卵巢癌细胞SKOV3PR(++),卵巢癌细胞H08910ER(++)卵巢癌细胞H08910PR(－)(2)卵巢癌细胞A2780IC50为2000ug/ml,卵巢癌细胞SKOV3IC50为2000ug/ml,卵巢癌细胞H08910IC50为100ug/ml(3)经SPSS软件分析,a三组卵巢癌细胞株杀伤率有昼夜节律差异性:不同时辰点的健择对卵巢癌细胞株H08910的抑制率存在明显的昼夜节律,有统计学意义,其峰谷值由脉冲图可以看出,峰值是第二天凌晨0am—4am,此时用药,对卵巢癌细胞的抑制率最大。谷值第一天早上8am—12N之间,此时杀伤率最低。不同时辰点的健择对卵巢癌细胞株SKOV3抑制率存在明显的昼夜节律,有统计学意义,峰谷值由余弦图可以看出峰值是第二天凌晨0am—4am,谷值第一天凌晨0am—4am之间或第二天凌晨4am-8am,不同时辰点的健择对卵巢癌细胞株A2780在体外48小时的抑制率昼夜节律无统计学意义b.同种细胞第一天昼夜节律与第二天昼夜节律差别性:健择对卵巢癌细胞株H08910的抑制率第一天峰值和谷值分别0am和8am,第二天峰值和谷值分别0am和20pm,差异有统计学意义,第二天峰值的抑制率明显大于第一天峰值此时用药,对卵巢癌细胞的抑制率最大。健择对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制率第一天峰值和谷值分别12N和4am第二天峰值和谷值分别4am和16pm差异有统计学意义,第二天峰值的抑制率明显大于第一天峰值c不同剂量的药物对同种细胞作用昼夜节律差别性:健择分别为2000ug/ml和3000ug/ml对SKOV3在体外48小时不同时点用药抑制率抑制率存在昼夜节律,两者峰值是第二天凌晨0am—4am,此时具最强杀伤功效。剂量2000ug/ml健择谷值第一天凌晨0am—4am之间,剂量3000ug/ml的健择谷值第二天凌晨4am-8am。d同剂量的药物对不同细胞作用昼夜节律不同:剂量为2000ug/ml的健择对SKOV3,A2780的抑制率在第一天峰谷值刚好相反,健择对SKOV3的抑制率处峰值时对A2780的抑制率处谷值。结论:(1)健择对ER(++)PR(－)卵巢癌细胞H08910在体外作用48小时不同时点用药抑制率杀伤率呈昼夜节律但有差异性,峰值是第二天凌晨0am—4am健择对ER(－)PR(++)卵巢癌细胞SKOV3在体外48小时不同时点用药抑制率抑制率存在昼夜节律,峰值是第二天凌晨0am—4am,此时具最强杀伤功效。(3)健择对ER(++)PR(－)卵巢癌细胞A2780的抑制率昼夜节律无统计学意义(4)卵巢癌细胞株的昼夜节律与ER.PR受体阴阳性无关