【摘 要】
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DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在调控基因转录表达,印记基因活性以及肿瘤发生发展等方面发挥重要作用。LSH是唯一一个被报道参与DNA甲基化动态调控的SNF2染色质重塑酶家族成员。LSH敲除小鼠整体DNA甲基化水平下降显著,目前基于小鼠的研究更加倾向于LSH参与起始性DNA甲基化调控,但是其分子机制仍存在一定争议,尚待完善。我们首先构建了LSH基因敲除的多种细胞系,包括人源He La、HCT1
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DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在调控基因转录表达,印记基因活性以及肿瘤发生发展等方面发挥重要作用。LSH是唯一一个被报道参与DNA甲基化动态调控的SNF2染色质重塑酶家族成员。LSH敲除小鼠整体DNA甲基化水平下降显著,目前基于小鼠的研究更加倾向于LSH参与起始性DNA甲基化调控,但是其分子机制仍存在一定争议,尚待完善。我们首先构建了LSH基因敲除的多种细胞系,包括人源He La、HCT116、MCF7以及鼠源NIH3T3细胞。对这些细胞系的DNA甲基化研究表明LSH敲除导致细胞整体DNA甲基化水平明显下降15%-20%,重新表达野生型LSH能回复DNA甲基化,而表达染色质重塑活性缺失的LSH则不能。进一步RRBS甲基化测序数据分析表明LSH敲除细胞系中DNA甲基化水平下降广泛发生于不同的基因组元件。为了区分LSH主要影响起始性还是维持性DNA甲基化,我们构建了起始性DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B(DNMT3A-/-/3B-/-)双敲除的He La细胞及DNMT3A、DNMT3B和LSH三敲除(DNMT3A-/-/3B-/-/LSH-/-)的细胞系,发现DNMT3A-/-/3B-/-细胞与对照He La细胞相比DNA甲基化水平略微下降（不足5%）,而DNMT3A-/-/3B-/-/LSH-/-细胞与DNMT3A-/-/3B-/-细胞相比DNA甲基化水平有显著下降,表明LSH主要正调控维持性DNA甲基转移酶DNMT1介导的DNA甲基化。根据文献报道,UHRF1结合半甲基化DNA,泛素化组蛋白H3,从而招募DNMT1来实现DNA甲基化的维持。我们发现,在LSH敲除的细胞中,UHRF1在DNA复制叉上结合减弱,组蛋白H3泛素化水平降低,表明LSH可能通过影响UHRF1与染色质结合调控维持性DNA甲基化。通过生化实验,我们确定LSH与UHRF1但不与DNMT1相互作用。我们还发现在UHRF1敲低的细胞中,LSH在DNA复制叉上的结合也减弱,提示LSH与UHRF1通过两者之间的相互作用,以协同互助的方式结合到DNA复制叉上参与DNA甲基化调控。此外,转录组测序以及甲基化测序联合分析表明,LSH敲除后,DNA甲基化下降与基因转录水平上调之间呈现很好的相关性。综上,我们研究结果表明在体细胞中LSH主要调控DNA维持性甲基化而不是起始性DNA甲基化。其作用机制主要是通过LSH与UHRF1相互作用及其染色质重塑活性,促进UHRF1与DNA复制叉的结合,促进UHRF1介导的组蛋白泛素化,进而促进DNMT1的招募和DNA维持性甲基化。
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