论文部分内容阅读
背景与目的：肿瘤血管生成为肿瘤恶性生长和转移提供营养和途径,因此抑制肿瘤血管生成成为肿瘤生物防治的新策略,在过去的十年引起了人们极大的兴趣和关注,目前数十种针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的血管生成抑制剂已进入临床试验。血管内皮细胞在血管发生中具有重要作用,通过抑制内皮细胞增殖可以抑制肿瘤血管生成,进而抑制肿瘤的恶性生长和转移。本研究采用人微血管内皮细胞模型(HMEC-1)比较不同工艺路线得到的王不留行提取物体外抑制血管生成的作用,选取药效好的组分进行急性毒理学及体内药效学的研究。研究方法：采用系统溶剂萃取法和按目标萃取将王不留行水提物及醇提物分别进行部位分离,得到有机萃取相14个组分,经旋蒸、冷冻干燥得冻干粉末。SRB法测定药物对人微血管内皮HMEC-1细胞增殖的影响及IC50大小；对活性较好的组分初步定性并用紫外分光光度法测定其皂苷含量；顶空法检测有效部位的正丁醇残留；划线法测定细胞迁移；通过测定细胞外液LDH的释放监测并比较不同提取部位的细胞毒性。按照常规急性毒理学方法,测定最小致毒量和最小致死量；取两剂量之间高(1000 mg/kg)、低(200 mg/kg)剂量观察不同组分的急性毒性,灌胃给药,测定给药前、给药后24小时、7天和14天各组小鼠的血压、自主活动和凝血时间,14天后解剖取组织称重并计算器官指数,HE染色观察重要脏器的病理变化；生化法测定组织SOD活力、MDA含量及血清BUN、GOT、GPT含量。建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,分空白对照组、模型对照组、王不留行提取物(A4)低剂量组(1 mg/kg)、中剂量组(2.5 mg/kg)及高剂量组(5mg/kg)。每天灌胃给药,观察荷瘤小鼠生长情况,待肿瘤长出后隔天测量肿瘤体积,给药13天后,取各鼠肿瘤组织及重要器官。HE染色观察病理学变化。TUNEL法测定细胞凋亡,免疫组化法检测肿瘤血管内皮标记物CD31表达。结果：经过活性筛选发现醇提物经系统溶剂萃取的正丁醇相A4、醇提物按目标萃取的正丁醇相A7、水提物经系统溶剂萃取的正丁醇相B4、水提物按目标萃取的正丁醇相B7活力较好。A4、A7、B4、B7四个组分IC50分别为6.44±0.2、12.78±0.4、7.25±0.07及10.35±0.21,药效依次为A4>B4>B7>A7;四个有效部位均含有皂苷,可能含有黄酮,其中皂苷含量为A4>B4>B7>A7,四个组分正丁醇残留含量均小于0.5%；给药24h后A4、A7、B4、B7迁移距离分别为19.78±3.14μm、30.56±6.99μm、20.99±1.69μm、36.88+0.42μm；在给药浓度为20μg/mL时细胞培养液LDH活性(U/L"1)与对照组比显著升高,分别为758.1±19.73、1006.54±129.41、1111.11±36.97及617.45±75.93。A4和B4最小致死量为1500 mg/kg,A7和B7的最小致死量范围在1750-2000 mg/kg；A4最小致毒量为100 mg/kg,其余为80 mg/kg；一次给药200 mg/kg后,各组小鼠的凝血时间变短,血压降低,14天时,除A7组血压降低外,各组小鼠凝血时间、血压均恢复正常,多数组织SOD活力及MDA含量没出现显著变化；一次给药1000 mg/kg后,与对照组比,各组小鼠的凝血时间变短,血压降低,14天时,B4、B7组血压升高,其余各组小鼠凝血时间、血压均恢复正常,组织SOD活力下降,MDA含量升高,血清GOT升高,GPT没有显著变化,血BUN升高；病理形态观察发现心、肝、脑、肺、肾等主要器官均出现病理改变。体内药效学显示：王不留行提取物能改善荷瘤小鼠的生活质量,抑制肿瘤生长,肿瘤组织出现大量坏死,肿瘤细胞凋亡,肿瘤血管内皮细胞标记物CD31表达下降。结论：四条路线中王不留行醇提取物按系统溶剂萃取法得到的正丁醇部位(A4)是相对活性好毒性小的有效部位。体外细胞水平评价显示该组分具有极强的细胞增殖、迁移抑制活性,体外LDH检测及体内急性毒理学也显示出较弱的毒性,体内药效研究发现该组分能抑制肿瘤生长。因此该组分具有望开发为抗肿瘤药物的五类新药。