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结肠癌是常见的严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤。目前结肠癌的治疗手段以手术治疗为主,辅以全身或局部放、化疗,但术后肿瘤易复发。提高结肠癌术后生存率和降低死亡率的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。深入研究大肠癌相关基因的表达并对其机理进行研究,有利于大肠癌的综合防治。乙醛脱氢酶家族包含由17个基因翻译成的一组同工酶,可分别催化不同底物,广泛分布于肝、肠等多种组织中。研究结果显示：ALDH1与肿瘤的发生、发展密切相关。ALDH1A2是催化视黄醛氧化成维甲酸的关键酶,维甲酸与维甲酸受体(retinoicacid receptor, RAR)以及维甲酸X受体(retinoic X receptora, RXR)通过配体结合区域结合,直接作用于靶基因,调节不同靶基因的表达,进而调控正常和肿瘤细胞的生长和分化。大量研究表明：ATRA可抑制肿瘤细胞生长、浸润、转移及粘附,使肿瘤细胞致瘤性及软琼脂克隆形成能力下降,使胃癌细胞株MKN45H对基底膜胶的粘附能力下降,并显著降低原胶原、纤维结合素及层粘连蛋白的合成,在抑制肿瘤的侵袭、转移过程中起着重要作用,ALDH1A2是体内合成ATRA的关键酶,我们设想ALDH1A2在抑制结肠癌细胞增殖、侵袭转移及粘附过程也将起着重要作用。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶,在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用,在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥着重要的作用。研究发现,在许多肿瘤组织中,都发现有较高MMP2的表达,且其表达程度与肿瘤的侵袭性有关。E-cadherin是介导上皮细胞间粘附的主要粘附分子,主要介导同质性细胞粘附,如瘤细胞与瘤细胞之间的粘附,因此E-cadherin表达减少,有助于肿瘤侵袭转移。本研究中,我们首先利用免疫组化技术、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定人结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin mRNA及蛋白的表达情况；随后利用基因扩增技术获得人ALDH1A2基因cDNA序列,构建pEGFP-N1-ALDH1A2表达载体并转染到人结肠癌细胞株LOVO细胞,获得稳定携带pEGFP-N1-ALDH1A2载体的LOVO,测定转染前后细胞中ALDH1A2mRNA及蛋白的表达,并利用紫外分光技术测定转染前后细胞中ALDH1A2的活性；采用MTT实验、克隆形成实验、Transwell小室侵袭实验、逆转录-PCR技术、免疫荧光技术及免疫印迹技术检测pEGFP-N1-ALDH1A2载体转染后对细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力的影响,并检测侵袭、粘附相关因子的表达,同时用ATRA作为阳性对照；最后为进一步研究ALDH1A2在结肠癌的作用机制,我们利用转染的细胞构建裸鼠移植瘤模型,观察不同裸鼠成瘤时间、瘤体平均体积,平均瘤重的不同,探讨ALDH1A2在体内对结肠癌的影响,以期找到ALDH1A2在结肠癌中的作用机制。本研究分为以下四个部分：第一部分ALDH1A2在结肠癌中的表达及意义方法：1.免疫组化检测52例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin蛋白的表达。2. RT-PCR技术检测20例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin mRNA的表达情况。3.免疫印迹技术检测20例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin蛋白的表达情况。结果：1.免疫组织化学、逆转录-PCR及免疫印迹技术结果显示：ALDH1A2、 E-cadherin在结肠癌癌旁组织表达高于结肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。MMP2在结肠癌组织中表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2. ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在结肠癌中的表达具有相关性。第二部分ALDH1A2基因过表达载体构建及鉴定方法：1.利用基因扩增技术获得人ALDH1A2基因cDNA序列,经酶切、回收并连接到真核细胞表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-ALDH1A2真核表达载体,并进行酶切及基因测序鉴定。2.利用脂质体转染技术将PEGFP-N1-ALDH1A2表达载体转染到人结肠癌细胞株LOVO细胞,并利用G418进行筛选。3.利用逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定转染前后细胞中ALDH1A2mRNA及蛋白的表达。4.利用紫外分光光度法测定转染前后细胞中ALDH1A2的活性。结果：1.酶切及基因测序结果表明成功构建pEGFP-N1-ALDH1A2表达载体2.转染及G418筛选后,获得稳定携带pEGFP-N1-ALDH1A2载体的LOVO。3.ALDH1A2mRNA及蛋白在转染pEGFP-N1-ALDH1A2载体的细胞中的表达高于未转染细胞。4.ALDH1A2活性在转染pEGFP-N1-ALDH1A2载体的细胞中的表达高于未转染细胞。第三部分ALDH1A2基因过表达对结肠癌细胞生物学功能的影响方法：1. MTT法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞增殖能力的变化。2.克隆平板形成实验检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞克隆形成能力的变化。3. Transwell小室侵袭实验检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞侵袭能力的变化。4.逆转录-PCR法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2、MMP2及E-cadherin mRNA含量。5.免疫荧光法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2. MMP2及E-cadherin含量。6.免疫印迹法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2、 MMP2及E-cadherin蛋白的含量。结果：1.MTT法检测结果显示ALDH1A2过表达抑伟(?)LOVO细胞的增殖。2.克隆形成实验显示ALDH1A2过表达降低了LOVO细胞克隆形成能力。3. Transwell小室侵袭实验证实ALDH1A2过表达能够抑制LOVO细胞的侵袭能力。4.RT-PCR、IF、Wb检测结果显示：与对照组相比,ALDH1A2组ALDH1A2、 E-cadherin mRNA及蛋白含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)；MMP2mRNA及蛋白含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)；ALDH1A2、MMP2及E-cadherin mRNA及蛋白在ATRA组与ALDH1A2组无显著改变,差异无统计学意义(P>0.05)。第四部分ALDH1A2基因过表达对移植瘤的影响方法：1.利用不同组别的LOVO细胞接种裸鼠构建移植瘤模型,观察不同组别裸鼠成瘤时间、瘤体平均体积,平均瘤重的改变。2.免疫组化法测定各组裸鼠瘤体组织ALDH1A2、MMP2、E-cadherin的表达。结果：1.成功构建LOVO细胞裸鼠移植瘤裸鼠模型,ALDH1A2组及ATRA组裸鼠成瘤时间较对照组明显延长,差异有统计学意义(P<0.05),ATRA组瘤重也较对照组明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。2.与对照组相比,ALDH1A2组裸鼠中ALDH1A2、E-cadherin含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)；MMP2含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)；ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在ATRA组与ALDH1A2组无显著改变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.人结肠癌组织中ALDH1A2、E-cadherin表达低于癌旁组织,MMP2表达高于癌旁组织,ALDH1A2、MMP2及E-cadherin三者密切相关。2.成功构建并鉴定了ALDH1A2基因过表达真核表达载体,并获得稳定过表达ALDH1A2的LOVO细胞。3. ALDH1A2过表达具有抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成、侵袭的作用,这种抑制作用可能于ALDH1A2的过表达,以及E-cadherin的高表达及MMP2的低表达相关。4.成功地建立了人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型,ALDH1A2过表达组裸鼠成瘤时间短、瘤重低,裸鼠组织中ALDH1A2、E-cadherin高表达,MMP2低表达。5. ALDH1A2可以通过调节MMP2及E-cadherin的表达,抑制结肠癌细胞生长、增殖、侵袭转移及粘附的作用