研究背景及目的意义背景：肛肠科治疗的疾病主要包括：肛瘘、痔疮、直肠脱垂、直肠肛管周围脓肿、直肠癌、肛裂等,这些疾病通常需要通过手术才能达到根治的目的,但手术后常会出现疼痛、水肿、出血、感染、创面延迟愈合等并发症,针对这些并发症除针对性治疗外,术后换药成为治疗这些术后并发症、促进创面愈合的重要手段。目前临床上常用的剂型一般为痔疮膏、痔疮栓之类,这些传统的药物剂型通过肛门给药,直接作用于手术创面或直肠黏膜发挥抗炎、镇痛、消肿等作用,但也同时存在与病变部位接触面小、分布不均匀、易融化排出、药效持续时间短、生物利用度低等缺点。正是基于目前肛肠疾病术后换药所用剂型受限的现状,赵宝明教授根据中医基础理论结合肛肠疾病自身的发病特点研制出一种中药泡沫气雾剂——广痛消泡沫气雾剂,它除具备抗炎、消肿、解痉镇痛等功效外,还具有喷出物不流动,泡沫稳定、持续时间长,药物在病灶部位作用时间长,涂布面广,均匀分散在腔道内,药物能有效地渗入黏膜皱襞等优点,其疗效优于其他剂型,是一种极具研发价值的剂型。“广痛消”中的”广”即广肠,包括乙状结肠和直肠,如《证治要诀》云”广肠,言其广阔于大小肠也”,表明了广痛消泡沫气雾剂可以作用的部位；”痛消”阐明该药有镇痛功效；“泡沫气雾剂”点明了该药的剂型。“广痛消泡沫气雾剂”精炼地概括了该中药复方的使用部位、疗效和剂型。广痛消泡沫气雾剂先后在广安门医院肛肠科及实验室、东直门医院肛肠科及中心实验室、北京中医药大学中药学院、军事科学院和北医病理系的协助下完成了该药的提取工艺、药物质量标准、药效、剂型优势和药物安全性等方面的研究。其动物实验和临床研究历时20余年,有着深厚的研究基础。目的：尽管目前已完成了该泡沫气雾剂部分药效的研究,但尚存在药物在体内吸收、代谢的情况不明确,其发挥作用的机理不清楚等情况,故本课题通过测定延胡索、当归、厚朴、细辛、白芍、黄柏、茜草的有效成分含量及健康人体的药代动力学研究以期对阐述其组方原理,对新药开发,质量评价及指导临床合理用药提供参考,也为今后该泡沫气雾剂的机制研究奠定基础。实验前期曾采用高效液相色谱法检测广痛消水提物中有效成分,但存在提取物的药效成分相互干扰严重,无法进行准确的定量分析；一些有效成分含量低,无明显的响应信号；操作繁琐、灵敏度低、分析速度慢、多成分含量同时测定色谱条件摸索困难等问题,故改用液质联用(LC-MS/MS)。液质联用技术是以液相色谱作为分离系统,质谱为监测系统,样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱的优势互补,将色谱对复杂样品的高分离能力,与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来,在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛应用。研究内容及结果一、广痛消水提物中5种有效成分的含量的测定目的：建立灵敏、快速、简便的液相色谱-串联质谱法测定广痛消水提物中主要有效成分(延胡索乙素、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚)的含量。方法：采用色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100mm×2.1mm,3.5μm),流动相A：0.1%甲酸水,B：乙腈,梯度洗脱,柱温30℃。质谱条件：ESI离子源,正、负离子检测方式,干燥气温度300℃,干燥气体流量10L·min-1；雾化器压力30Pa；毛细管电压正离子4000V,负离子3500V,用于定量分析的离子反应m/z分别为芍药苷(m/z479.2→m/z121)、延胡索乙素(m/z356.2→m/z192.2)、盐酸小檗碱(m/z336.1→m/z320.2)、厚朴酚(m/z265.1→m/z247.1)、和厚朴酚(m/z265.2→m/z233.1)、内标布洛芬、消旋山莨菪碱监测离子对分别为m/z205.1→m/z161.1,m/z306.1→m/z140。结果：芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚均得到精确的分析,线性范围分别为：0.8828125-113(r=0.9998)；1.54375-49.4(r=0.9995)；0.9046875-115.8(r=0.9997)；0.88125-112.8(r=0.9994)；0.165625-21.2(r--0.9999)。加样回收率分别为1.998%,1.14%,3.117%,1.828%,1.596%。结论：该方法灵敏度高、分析速度快、定性能力强、定量能力好,可同时测定广痛消水提物中5种主要有效成分含量。二、广痛消泡沫气雾剂直肠给药的健康人体药代动力学研究目的：建立快速、灵敏的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法直接测定健康人体血浆中延胡索乙素、盐酸小檗碱的含量,求取药动学参数。方法：血浆样品以丙酮沉淀蛋白,80%乙腈萃取,对广痛消水提物中5种有效成分含量测定的色谱、质谱条件进行微调,色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100mm×2.1mm,3.5μm),流动相A：0.1%甲酸水,B：乙腈,0～lmin(B15%、0.2mL/min)；1～2min(B15%～40%,0.3mL/min);2～7min(B40%～80%,0.3mL);7～8min (B80%～15%,0.3mL/min);8～10min(B15%,0.3mL/min);10～11min(B15%,0.2mL/min);12min(B15%,0.2mL/min)质谱条件：ESI离子源,正离子检测方式,干燥气温度300℃,干燥气体流量10L·min-1；雾化器压力30Pa；毛细管电压正离子4000V,监测离子对分别为盐酸盐酸小檗碱(m/z479.2→m/z121),延胡索乙素(m/z356.2→m/z192.2),内标消旋山莨菪碱(m/z306.1→m/zl40),自动进样盘温度15℃,柱温30℃,并进行了系统的方法学评价。结果：延胡索乙素和盐酸小檗碱在各自的生物样品浓度范围内,均呈良好线性,r>0.99；其各成分的线性范围分为：0.000594-1.188ng/mL,0.000536-1.072ng/mL,最低定量限为：0.000536ng/ml,日内、日间精密度均小于15%,提取回收率均大于85%,8名健康志愿者肛门给广痛消泡沫气雾剂后,延胡索乙素、盐酸小檗碱的主要药代动力学参数Tmax分别为：132.5±25.4951min和132.5±30.11881min,Cmax分别为：0.550738±0.300594ng/ml和0.3108±0.324596ng/ml, T1/2分别为69.37085±72.60998min和57.06471±39.74188min, AUClast分别为46.2976±27.85874min*ng/mL和28.25056±28.34036min*ng/mL,结论：该方法操作简单,效率高,选择性好,灵敏度高,可成功用于广痛消泡沫气雾剂的健康人体血浆的动力学研究。