研究背景和目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大多数心血管疾病、卒中和外周血管疾病的重要病因,是一种以内膜增厚和斑块形成为特征的局灶性血管疾病。目前认为,动脉粥样硬化既与代谢紊乱相关,又是一个与炎症密切相关的动态过程,涉及内皮功能障碍、巨噬细胞和血管平滑肌细胞增殖和凋亡,内膜钙化等。动脉粥样硬化的特点是单核细胞渗入大、中动脉壁,形成动脉粥样斑块。单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞分化,其中一些细胞发生凋亡和继发性坏死,形成坏死核心,斑块易破裂形成临床不良事件如心肌梗死和脑卒中等。单核细胞/巨噬细胞通过维持血管壁脂质稳态和调节炎症反应在此过程中发挥关键作用,在动脉粥样硬化不同阶段表现出功能的多样性。斑块巨噬细胞表现出几种不同的表型,一般认为M1型巨噬细胞与炎症、易损斑块有关,M2型巨噬细胞被认为具有较厚的纤维帽,破裂风险较小。冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD)是一种以心外膜血管动脉粥样硬化斑块积聚为特征的病理过程。临床上将CHD分为两大类:稳定性冠心病(stable coronary artery disease,SCAD)和急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)。根据2018年中国稳定性冠心病诊断与治疗指南中的定义,SCAD指慢性稳定性劳力型心绞痛、缺血性心肌病和ACS之后稳定的病程阶段。SCAD占CHD的大部分,其流行病学和发病率较难评估,总体而言在中年女性中较男性更常见,但随着年龄的增加出现了相反的特征,在老年男性中更为常见。SCAD患者预后相对较好,混合人群估测年死亡率为1.2%-2.4%,心脏性死亡的发生率约为0.6%-1.4%。一般而言,合并心力衰竭、LVEF降低,病变血管支数多,冠脉近端狭窄明显,缺血范围广,多器官功能受损,高龄,显著抑郁的患者其预后较差。预后评估是SCAD患者管理的重要组成部分。SCAD尽管相对于冠状动脉疾病急性事件上来看是稳定的,但潜在的病理生理状态却并不一定稳定,甚至可能在任何时候变得不稳定。因此,如何早期识别、及时诊断、准确处理这些“沉默的杀手”,对于降低心血管死亡率,改善冠心病患者预后具有重大临床意义。建立稳定可靠的SCAD患者的风险评估或者完善的二级预防体系是SCAD患者管理的重要组成部分。目前对SCAD患者主要根据危险因素、临床症状学(特别是心绞痛严重程度)及必要的无创/有创性检查方法(负荷心电图、单光子发射计算机断层显像、心脏核磁共振、冠脉CTA、冠脉造影等)进行预后评价。而SCAD患者不良预后与不稳定斑块密切相关。上述方法均不能直接识别不稳定斑块。目前识别不稳定斑块的方法主要包括有创性影像学检查、无创性影像学检查和炎性标志物检测。但动脉粥样硬化是一个动态过程,从患者整个冠脉血管床来看,动脉粥样硬化斑块的发生、进展、斑块形成、破裂及修复是时刻在进行的。无论是有创性还是无创性影像学检测方法,对于动脉粥样硬化疾病的发展预测所提供的信息是有限的。目前尚无一种手段能够完全或者相对全面的反映上述过程。众所周知,炎症在动脉粥样硬化发生、进展、斑块形成、破裂中都有重要作用。炎性标志物在冠心病尤其是SCAD病人中的临床研究由来已久,并显示出很好的临床诊断和预后价值,为冠心病的一级预防和二级预防以及高危人群的筛选和预后的危险分层提供了重要的临床参考价值。Mac-2结合蛋白(Mac-2 binding protein,M2BP)是活化巨噬细胞分泌的半乳糖结合凝集素的结合蛋白,是一种分泌型的高度糖基化蛋白,是MSR富半胱氨酸结构域超家族成员,在血浆中易被检测到,是目前公认的病毒感染和癌症的生物标志物。体外研究中发现M2BP是一种可测且可溶的M1巨噬细胞标志物。临床研究中发现M2BP在亚临床颈动脉粥样硬化中表达上调并与相关生物学标志物呈正相关,在正常人群中可以反映隐匿性动脉硬化。在对冠心病患者的研究中表明,和健康人群相比冠心病患者外周血M2BP水平高表达,在ACS患者中M2BP水平较SCAD明显升高,且M2BP高表达提示预后不良。上述研究虽初步揭示了 M2BP和动脉粥样硬化相关,但并未对其机制进行深入的探索研究。目前也缺乏M2BP在稳定性冠心病患者危险分层中的临床数据,且没有完善的SCAD患者风险评估体系。有鉴于此,我们采用了基础和临床相结合的实验方法,目的在于探索M2BP在动脉粥样硬化和斑块不稳定过程中的致病机制,探讨循环M2BP水平对SCAD患者预后的预测价值,并基于循环M2BP水平建立SCAD患者的风险预测模型。研究方法第一部分M2BP在动脉粥样硬化中的致病机制研究1.M2BP基因敲除对ApoE-/-小鼠主要代谢指标、动脉粥样硬化进程及斑块成分的影响实验动物为ApoE-/-小鼠及M2BP-/-+ApoE-/-双基因敲除小鼠,均为8-10周龄,雄性。适应性喂养2周后过渡至高脂喂养12周。在开始高脂饮食喂养前和高脂饮食喂养后12周,采用眼球取血法取两种小鼠的血清,检测比较两组小鼠的体重和主要血脂成分水平。应用RT-PCR比较高脂饮食喂养前后ApoE-/-小鼠M2BP mRNA水平的变化。剪取升主动脉至腹主动脉段于冻存管中,液氮速冻,保存于-80℃冰箱,主动脉大体油红O染色,Image pro plus软件分析比较ApoE-/-小鼠和M2BP-/-+ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化面积。分离心脏、主动脉和周围组织,剪下心脏。部分样本浸泡于4%多聚甲醛溶液固定24-48小时,之后石蜡包埋,通过HE染色、天狼星红染色和免疫组织化学的方法比较两组小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块的组分。2.M2BP基因敲除对于骨髓单核-巨噬细胞(BMDMs)迁移活性以及与血管内皮细胞粘附以及迁移的影响1)应用Western blot 比较未分化的THP-1细胞和活化分化成为巨噬细胞之后M2BP蛋白表达水平。2)应用transwell趋化实验,分别比较ApoE-/-小鼠和M2BP-/-+ApoE-/-小鼠在有无MCP-1作为化学趋化剂时的迁移能力和活性。3)细胞粘附实验比较ApoE-/-小鼠和M2BP-/-+ApoE-/-小鼠单核-巨噬细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的粘附能力。4)对ApoE-/-小鼠和M2BP-/-+ApoE-/-小鼠应用布鲁尔巯乙酸盐作为诱导剂(2 mL,浓度为3%)分别制作两组腹膜炎的活体小鼠模型,定向诱导活体小鼠循环中单核细胞向腹膜后定向聚集,模拟单核-巨噬细胞的分化过程。3天后,处死小鼠,收集腹腔灌洗液。应用巨噬细胞特异性抗体CD11b标记巨噬细胞并计数。3.M2BP对于MAPK信号转导通路活化的影响及相应BMDMs迁移活性以及与粘附能力的比较1)Western blot 比较 ApoE-/-小鼠和 M2BP-/-+ApoE-/-小鼠 MAPK 信号转导通路的活化。2)细胞粘附实验比较不同浓度的rhM2BP(0、0.5、1、5 ug/ml)体外刺激对于ApoE-/-小鼠BMDMs粘附的影响。3)应用transwell趋化实验比较不同浓度的rhM2BP(0、0.5、1、5 ug/ml)体外刺激对于ApoE-/-小鼠BMDMs迁移的影响。4)Western blot检测不同浓度的rhM2BP(0、0.5、1、5 ug/ml)体外刺激的ApoE-/-小鼠BMDMs的p38-MAPK的磷酸化激活情况。5)构建ApoE-/-+Lenti-p38小鼠模型:高脂喂养8周的ApoE-/-小鼠,尾静脉注射200ul含有107TU的p38MAPK-shRNA慢病毒。之后继续高脂喂养4周。分离、培养小鼠BMDMs。6)Western blot 检测 ApoE-/-小鼠、M2BP-/-+ApoE-/-小鼠及ApoE-/-+Lenti-p38小鼠BMDMs p38-MAPK的磷酸化活化程度。7)Transwell 趋化实验比较 ApoE-/-小鼠、M2BP-/-+ApoE-/-小鼠及ApoE-/-+Lenti-p38 小鼠 BMDMs 迁移能力。8)细胞粘附实验比较ApoE-/-小鼠、M2BP-/-+ApoE-/-小鼠及ApoE-/-+Lenti-p38 小鼠 BMDMs 与 HUVECs 的粘附能力。9)应用布鲁尔巯乙酸盐作为诱导剂,制作ApoE-/-小鼠、M2BP-/-+ApoE-/-小鼠及ApoE-/-+Lenti-p38小鼠活体腹膜炎模型,比较三组小鼠活体单核-巨噬细胞迁移能力。第二部分基于循环M2BP水平稳定性冠心病风险预测模型的建立连续纳入2016年1月至2016年12月期间在山东省立医院心内科住院的SCAD患者共336例。入院后常规采集病史,肘静脉取血采集血清,ELISA法测定M2BP浓度。随访24个月,研究终点为1)需入院治疗的再发心绞痛,2)非致死性急性心肌梗死,3)心源性死亡,4)其他原因引起的死亡。将需入院治疗的再发心绞痛,非致死性急性心肌梗死,心源性死亡定义为主要不良心血管事件(Major Adverse Cardiovascular Events,MACE)。根据SCAD患者血清M2BP水平的三位数将其分为低M2BP水平组(1st)、中M2BP水平组(2nd)、高M2BP水平组(3rd)。对三组采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,log-rank检验比较各组终点事件发生率的统计学差异。运用Cox风险比例模型来判断本次研究队列中影响SCAD患者预后的独立危险因素。在此我们采用了两种建模方法:1)单因素Cox回归模型筛选对结局具有统计学关联的因素,对于p<0.1的变量以及临床考虑与SCAD预后相关的因素,再纳入多因素Cox回归模型中继续筛选,选出最终有统计学意义(p<0.05)的变量作为危险因素。2)在Cox分析中选择“输入”法,纳入不同的临床变量,构建多个Cox模型,比较其HR值以分析M2BP是否对终点事件的发生有独立预测价值。对方法1)中最终构建的Cox风险比例模型绘制列线图进行可视化呈现。采用Bootstrap自抽样法,利用建模自身的数据,进一步验证模型的预测效果。一致性指数(C-index)用于评估所构建预测模型的效能。决策曲线分析(Decision Curve Analysis,DCA)用于探索临床实用性。结果第一部分M2BP在动脉粥样硬化中的致病机制研究1.M2BP基因敲除对于ApoE-/-的主要代谢指标:体重、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及甘油三酯(TG)水平无明显影响。2.高脂饮食喂养后,ApoE-/-小鼠的M2BP mRNA水平明显升高5倍以上(P<0.01)。3.主动脉大体油红O染色显示,高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-小鼠相比,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化的面积减少了约27%(12.3±0.34%vs 16.9±0.29,p<0.01)。4.HE染色结果显示,相较于ApoE-/-小鼠,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠有着较低的动脉粥样硬化程度(11.9±0.25%vs 15.9±0.39,p<0.01)。胶原成分染色(天狼星染色)、巨噬细胞特性标记物CD68和血管平滑肌细胞特异性标记物α-SMA免疫组织化学染色提示相较于ApoE-/-小鼠,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠有着较低的胶原成分、较少的平滑肌细胞和较少量的巨噬细胞聚集。5.Western blot结果显示,与未分化的THP-1单核细胞相比,THP-1单核细胞活化分化成为巨噬细胞之后,M2BP蛋白表达水平上调了 230%左右。6.与ApoE-/-小鼠相比,来源于M2BP-/-+ApoE-/-小鼠的BMDMs,在没有MCP-1作为化学趋化剂时,表现出较弱的迁移能力和活性,而这种能力并没有随着MCP-1(50ng/ml)加入而有所改善或者逆转。同样,来源于M2BP-/-+ApoE-/-小鼠的BMDMs有着较弱的与HUVECs粘附的能力,并且此种情况并没有随着时间的延长而有所改善。7.腹膜炎的活体小鼠模型中,与ApoE-/-小鼠相比,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠腹腔灌洗液中巨噬细胞的数量明显减少(4.12*106 vs 7.96*106,p=0.035)。8.Western blot 显示,与 ApoE-/-小鼠相比,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠 p38-MAPK 活性的明显降低,ERK-MAPK和JNK-MAPK活性却没有明显变化。9.分析不同浓度的rhM2BP体外刺激对BMDMs迁移、粘附的影响,同时Western blot检测相应的p38-MAPK的磷酸化激活情况。结果表明,M2BP浓度依赖性的促进BMDMs的迁移以及与HUVECs的粘附,与之同步的是p38-MAPK活性的M2BP浓度依赖性的增强。10.应用载有p38干扰RNA的腺病毒转染ApoE-/-小鼠。Western blot证实,ApoE-/-小鼠有着最显著的p38-MAPK活化程度,M2BP-/-+ApoE-/-小鼠次之,p38 RNAi小鼠最低。同时与上述趋势相对应一致的是BMDMs迁移、粘附以及腹膜后巨噬细胞的趋集。第二部分基于循环M2BP水平稳定性冠心病风险预测模型的建立1.根据M2BP浓度的三分位,将受试者分为三组。三组间性别、年龄、高血压史、糖尿病史、血脂异常病史、吸烟方面没有显著差异。M2BP浓度高组(2nd、3rd)较低浓度组(1st)陈旧性心肌梗死的发病率高(6.35%vs 30.63%vs 30.91%,p<0.001)。2.发生MACE患者M2BP水平明显高于未发生MACE患者(15.32(12.45-21.92)vs 11.42(8.36-15.07)μg/ml,p<0.001)。3.生存分析显示,随着M2BP水平增加,需入院治疗的再发心绞痛(p=0.017)、非致死性急性心肌梗死(p=0.062)、全因死亡(p=0.046)和MACE(p=0.0001)的无事件生存率均降低,其中非致死性急性心肌梗死p值未达到统计学意义,但仍有该趋势。4.多因素 Cox 风险比例模型的变量为 M2BP(HR=1.1528,95%CI=1.1028-1.2051,p<0.001),既往心肌梗死病史(HR=3.3598,95%CI=1.7855-6.3221,p<0.001),超敏肌钙蛋白 T(HR=1.3145,95%CI=1.1531-1.4985,p<0.001)。计算最终模型的 C-index 为 0.852。结论1.在各种动脉粥样硬化致病因素作用下,M2BP参与了动脉粥样硬化发生发展的过程。2.M2BP至少通过p38-MAPK细胞内信号转导通路参与了单核-巨噬细胞活化、定向趋集以及粘附等病理生理过程。3.循环M2BP水平对SCAD患者预后具备良好的独立预测价值。4.基于循环M2BP水平建立SCAD患者风险预测模型,其预测价值较高,有效性及可靠性较强。