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研究背景：PRKAG2 G100S是我科张静博士于2007年在一个中国人心肌肥厚合并传导异常及心室预激家系中发现的一个新的PRKAG2基因错义突变。该家系患者临床表现有心肌肥厚(56%)、预激综合征(46%)、窦房结功能不良或高度房室传导阻滞、猝死,有的还伴有房颤、房扑等房性心律失常,符合国外PRKAG2心脏综合征家系报道的共性。经过对该家系成员进行PRKAG2基因测序,发现PRKAG2基因第3外显子上出现第100位甘氨酸突变为丝氨酸(PRKAG2 G100S),考虑其可能是导致该家系患者心肌肥厚及传导系统异常的致病基因,因此我们认为PRKAG2 G100S可能导致中国人PRKAG2心脏综合征的发生。2001年Gollob等提出PRKAG2心脏综合征是一种心脏特异的糖原综合征的假说,认为心肌肥厚及心室预激等临床表型可能与心肌细胞内的过度糖原累积有关。此后,有研究认为PRKAG2基因可能参与心脏的发育过程并导致心脏旁道的形成,因此研究人员认为应从心脏发育和能量代谢异常的视角了解PRKAG2突变的致病机制。然而,最近研究发现心肌糖原累积并不能完全说明心肌肥厚的发病机制,AMPK的异常活化可能影响细胞内信号转导途径从而导致心肌肥厚。PRKAG2 G100S是首次发现的一个导致中国人PRKAG2心脏综合征的新突变,在国内外均未见报道,其引起家系患者心肌肥厚的致病机制还不清楚。为明确PRKAG2 G100S突变对心肌细胞糖代谢和心肌肥厚标志基因表达的影响,深入认识PRKAG2心脏综合征的疾病本质,本课题通过在SD乳鼠心肌细胞及H9c2胚胎心肌细胞中过表达PRKAG2 G100S突变基因,研究该突变基因是否引起心肌细胞内糖原累积、Ca2+稳态失衡、心肌肥厚标志基因表达增加,初步阐明PRKAG2 G100S新突变引起中国人PRKAG2心脏综合征的致病机制。目的：研究PRKAG2 G100S新突变对心肌细胞内糖代谢、Ca2+稳态以及心肌肥厚标志基因表达的影响。方法：(1)携带野生型及突变型PRKAG2基因的重组腺病毒载体构建：利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2 G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向BP重组至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组反应,形成共表达目的基因及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒表达克隆。经筛选阳性表达克隆并测序验证后,Pad酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒。病毒PCR鉴定并确定病毒滴度。(2)乳鼠心肌细胞的培养及重组腺病毒感染心肌细胞：培养乳鼠心肌细胞,用重组腺病毒感染并使用Western blot技术鉴定PRKAG2蛋白是否在心肌细胞内正确表达。(3)重组腺病毒感染H9c2胚胎心肌细胞及细胞内Ca2+检测：用构建好的重组腺病毒感染H9c2胚胎心肌细胞,使用Western blot技术鉴定PRKAG2蛋白是否在心肌细胞内正确表达；以Roth-2/AM为钙指示剂,使用流式细胞荧光定量技术检测细胞内Ca2+浓度。(4)重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞及细胞内糖原含量、ANP、α-MHC、β-MHC基因水平检测：用构建好的重组腺病毒感染SD乳鼠心肌细胞,使用periodic acid-schiff (PAS)染色检测心肌细胞内糖原含量以及使用Real-time qPCR技术检测心房利钠肽(atrial natriuretic factor,ANP)、β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC) mRNA的表达水平。结果：(1)成功构建了携带EGFP基因的PRKAG2突变体重组腺病毒及野生型重组腺病毒,PCR鉴定结果表明PRKAG2基因正确插入腺病毒载体。病毒的滴度为：Ad-PRKAG2-IRES-EGFP 7.8×108ifu/ml, Ad-PRKAG2 G100S-IRES-EGFP 8.4×108ifu/ml。(2)成功培养了SD乳鼠心肌细胞并建立了过表达正常或突变PRKAG2基因的乳鼠心肌细胞模型；荧光显微镜下可见突变体及野生型重组腺病毒感染后的SD乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光；Western blot证明PRKAG2蛋白成功在乳鼠心肌细胞中过表达。(3)在H9c2胚胎心肌细胞成功过表达正常或突变的PRKAG2基因,Western blot证明PRKAG2蛋白过表达成功；心肌细胞内Ca2+检测显示重组腺病毒感染H9c2胚胎心肌细胞24-48小时,突变(GS)组(12.72±7.68)细胞浆内Ca2+浓度与阴性对照(PK)组(17.28±7.79)、空白对照(GFP)组(19.33±5.50)组间差异无统计学意义(P>0.05)；重组腺病毒感染H9c2胚胎心肌细胞48-72小时,突变(GS)组(24.18±2.43)细胞浆内Ca2+浓度与阴性对照(PK)组(26.24±4.77)、空白对照(GFP)组(26.04±5.71)组间差异无统计学意义(P>0.05)；重组腺病毒感染H9c2胚胎心肌细胞48小时前后,突变(GS)组、阴性对照(PK)组及空白对照(GFP)组的细胞浆内Ca2+浓度差异无统计学意义(P>0.05)。(4)重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞后,检测乳鼠心肌细胞糖原含量并检测细胞内ANP、α-MHC、β-MHC的基因表达水平。PRKAG2G100S突变使乳鼠心肌细胞质内有明显糖原累积,而未突变组(阴性对照(PK)组、空白对照(GFP)组)糖原累积较少。重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞48-72小时,突变(GS)组(1.00±0.04)ANP mRNA水平与阴性对照(PK)组(1.00±0.10)、空白对照(GFP)组(1.00±0.06)间差异无统计学意义(P>0.05)；α-MHC mRNA水平,突变(GS)组(1.00±0.13)与阴性对照(PK)组(1.00±0.00)、空白对照(GFP)组(1.05±0.38)组间差异无统计学意义(P>0.05)；β-MHC mRNA水平,突变(GS)组(1.04±0.33)与阴性对照(PK)组(1.00±0.04)、空白对照(GFP)组(1.09±0.53)三组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：(1)PRKAG2 G100S未能引起心肌细胞内钙稳态失衡,表明Ca2+及其依赖的信号转导途径可能未参与心肌肥厚的发病过程；同时表明PRKAG2 G100S导致的AMPK活性异常改变可能对心肌细胞钙稳态的影响较小。(2)PRKAG2 G100S未能引起心肌细胞内ANP、α-MHC及β-MHC mRNA水平明显改变,表明其对ANP、α-MHC及β-MHC基因的表达水平可能无明显影响。(3)PRKAG2 G100S引起心肌细胞内糖原累积,表明PRKAG2 G100S导致心肌肥厚的致病机制可能主要是心肌细胞内糖原累积。