半乳糖凝集素家族(Galectins)目前已发现16个成员,能够特异地解读和应答β-半乳糖基化信息,在生物体内广泛分布并且能够参与到几乎所有的生理过程中。半乳糖凝集素-4(Galectin-4)属于串联重复型亚家族的一员,包含两个结构保守却不同糖识别结构域(CRD),分别为N端的Galectin-4N和C端的Galectin-4C,两个CRDs由一段长度可变且易于水解的连接序列(Linker)相连,N端还具有18个氨基酸的前导序列。两个具有35%序列相似性的CRDs能够同时结合不同的配体,因而半乳糖凝集素-4可以充当大量生理过程中关键的交联剂和调节器。该蛋白能够交联硫酸化的鞘糖脂和胆固醇、N-和O-连接的糖蛋白及人类血型抗原,在脂筏的稳定、蛋白的顶点转运、细胞粘附、伤口愈合、肠道炎症和肿瘤发生中发挥重要作用。除两个CRDs外,半乳糖凝集素-4的其他结构域也能够影响整个蛋白的构象稳定、配体结合和生物功能的发挥。人源半乳糖凝集素-4主要在胃肠道上皮细胞中表达,在消化道肿瘤细胞中异常表达,且其水平的变化依赖于具体的肿瘤类型及发展恶化程度,因此可作为开发新型诊断策略和设计创新药物的靶点。本文致力于发现与人源半乳糖凝集素-4的胞内相互作用蛋白网络和筛选天然多糖配体,旨在为天然药物的开发提供线索。具体研究内容和成果如下:首先,成功构建了半乳糖凝集素-4的全长和七个截短片段的原核重组质粒,均在E.coli BL21(DE3)中过表达,通过亲和层析等方法纯化获得了八个蛋白片段。各截短片段的得率存在明显差异,半乳糖凝集素-4全长蛋白稳定性较差,而缺少前18个氨基酸的Galectin-4-19-323则能够被稳定纯化。然后,本文利用鸡血红细胞凝集和蛋白质差异扫描荧光试验两种方法探究了半乳糖凝集素-4截短片段的活性和稳定性以及与多糖配体的相互作用情况。通过比较八个蛋白片段使鸡红细胞完全凝集时蛋白的最低蛋白浓度,结果表明单个CRD的凝集作用很弱,而包含前导序列和连接序列的片段凝集活性明显增强,证明了传统的非功能结构域对半乳糖凝集素-4交联作用的发挥可能是必要的。在差异扫描荧光法的蛋白熔解过程中,Galectin-4C的熔解温度(Tm值)比Galectin-4N和Galectin-4-19-323更高,具有更好的稳定性。选取已报道的和半乳糖凝集素-3具有相互作用的酸碱修饰的柠檬果胶(pH-modified citrus pectin,MCP)、土豆半乳聚糖(Potato-galactan,PGA)、阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan,AG)、I型鼠李聚半乳糖醛酸(Rhamnogalacturonan I,RG-I)、水提人参粗糖(Water extraction of Ginseng penuche,WGP)这五种天然多糖组分为材料,通过抑制半乳糖凝集素-4截短片段的凝血作用,比较五种多糖完全抑制红细胞凝集的最低糖浓度(MIC),能够对多糖和截短蛋白间的相互作用进行半定量,筛选出半乳糖凝集素-4的天然多糖配体。检测结果表明几种多糖中,WGP对八个截短蛋白的抑制作用较好且为半乳糖凝集素-4的优良天然多糖配体,AG无抑制效果,其他三种多糖抑制效果较差且多呈现不完全抑制凝集的现象。通过差异扫描荧光法检测五种多糖与三个截短蛋白(Galectin-4N、-4C和-19-323)的相互作用,以乳糖为对照比较多糖添加剂存在下三个蛋白片段的熔解温差(ΔTm),结果表明五种多糖与各截短蛋白均无明显的相互作用。最后,通过Pull-down和免疫共沉淀试验筛选了半乳糖凝集素-4的胞内配体。以His6-Ni-NTA为亲和体系的Pull-down试验检测出去唾液酸胎球蛋白(ASF)与半乳糖凝集素-4截短蛋白均存在不同程度的相互作用,并且均能够被乳糖完全抑制。利用Co-IP从结肠癌HT29细胞中筛选获得了许多与Galectin-4-19-323相互作用的可疑配体蛋白,经蛋白质谱检测电泳结果中的一条目标蛋白条带,鉴定出一个大小245 kDa、丰度高达94.9%的复杂融合蛋白——氨基甲酰磷酸合成酶II-天门冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酸酶融合酶,是嘧啶从头合成的关键酶。