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目的:精子发生是由精原细胞（Spermatogonial cells,SCs）在睾丸曲细精管中完成,整个过程高度协调、有序进行。SCs作为一种生殖干细胞,与胚胎干细胞一样具有增殖、分化潜能,一方面通过自我更新维持其自身数目的相对恒定;另一方面不断分化成各种过渡型精原细胞,最后生成精子。对成年男性来说,SCs是唯一可以传递遗传信息给后代的细胞。作为精子生成的前体细胞,SCs在非梗阻性无精子症患者的治疗、青春期前男性癌症患者的生育力保存、转分化为其它细胞类型进行细胞替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。睾丸组织内SCs数量有限是限制其研究及应用的主要原因。饲养层细胞能为SCs增殖提供多种必要的细胞因子和递质,然而饲养层细胞让SCs的体外培养条件复杂且不可控。除了GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）和FGF2（fibroblast growth factor 2）以外,已知促进SCs体外增殖的生长因子数量很少,发现新的细胞因子及各个细胞因子之间的相互作用对于充分理解SCs的发育微环境非常关键。此外,发现新的利于SCs增殖的细胞因子为实现无饲养层培养,以及不断了解SCs的生物学特性意义重大。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）分泌的各种自分泌/旁分泌因子在很大程度上负责这些细胞的治疗作用。人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）不仅具有MSCs的各种特征,还具有组织来源丰富、免疫原性差、增殖稳定等优点,适合临床治疗;因此,hAMSCs在自体细胞修复和再生方面具有广阔的应用前景。hAMSCs分泌的细胞因子中是否存在有利于SCs增殖的细胞因子未见报道。基于我们课题组前期的研究结果,hAMSCs分泌蛋白组中存在与细胞增殖有关的蛋白。本研究为了探索人羊膜间充质干细胞条件培养基（hAMSCs-CM）是否能促进SCs体外增殖,以及hAMSCs-CM中是否存在未知的细胞因子可用于提高SCs的体外扩增效率。我们的研究目的是:1)研究hAMSCs-CM对SCs体外增殖的影响。2)通过生物信息学分析筛选hAMSCs外分泌蛋白中与细胞增殖有关的候选蛋白。3)深入研究目的蛋白POSTN对SCs增殖的影响及其具体作用机制。4)进一步研究POSTN对SCs增殖、分化的影响。研究方法:一、HAMSCs-CM对SCs体外增殖作用的研究1.用酶解法提取hAMSCs,通过流式细胞技术鉴定其细胞表面标志物,同时在成骨、成脂和成软骨分化培养基等培养条件下对其分化潜能进行鉴定。2.将hAMSCs在无血清条件下培养24小时,收集培养液上清作为条件培养基以备后续实验。3.采用两步酶消化法分离人SCs,不同浓度（0、25%、75%、100%）的hAMSCs-CM与SCs共培养不同时间（0、24、48、72、96小时）,用MTS实验检测hAMSCs-CM对SCs体外增殖的影响。4.用MTS实验分别检测不同浓度（0、25%、75%、100%）的hAMSCs-CM与GC-1 spg细胞共培养不同时间（0、24、48、72、96小时）后SCs体外增殖情况。并用EdU实验评估不同浓度（0、25%、75%、100%）hAMSCs-CM与GC-1spg细胞共培养24小时后对GC-1 spg细胞体外增殖的影响。5.通过生物信息学方法分析hAMSCs-CM中的外分泌蛋白,筛选出其中与细胞增殖相关的候选蛋白。6.通过ELISA验证hAMSCs-CM中候选蛋白POSTN、THBS1的表达情况。二、POSTN对GC-1 spg细胞增殖及其作用机制的研究1.分别将不同浓度（0、10、50、100、200ng/mL）的POSTN和THBS1与GC-1 spg细胞共培养不同时间（0、24、48、72、96小时）,采用MTS实验检测不同浓度POSTN、THBS1对GC-1 spg细胞增殖的影响。2.采用siRNA干扰将hAMSCs中的POSTN沉默,24小时后用Real-time PCR方法检测hAMSCs中POSTN表达量的变化;收集POSTN沉默后的hAMSCs-CM,ELISA方法检测hAMSCs-CM中POSTN表达量的变化。3.利用MTS实验检测POSTN沉默后的hAMSCs-CM与GC-1 spg细胞共培养不同时间（0、24、48、72、96小时）对GC-1 spg细胞增殖的影响。4.先用Wnt通路抑制剂XAV939对GC-1 spg细胞进行预处理,通过MTS实验检测POSTN与GC-1 spg细胞共培养不同时间（0、24、48、72、96小时）对GC-1spg细胞增殖的影响。同时XAV939预处理后,POSTN与GC-1 spg细胞共培养24小时后,用EdU实验检测其对GC-1 spg细胞增殖的影响。5.Wnt通路抑制剂XAV939预处理后,POSTN与GC-1 spg细胞共培养,Western Blot检测POSTN作用后Wnt通路下游作用蛋白GSK3β、β-catenin和Cyclin-D1的表达情况。6.利用流式细胞术检测POSTN对GC-1 spg细胞周期的影响。三、POSTN对人SCs体外增殖的研究1.用酶消化法分离人SCs,并用免疫荧光、RT-PCR方法对细胞进行鉴定。2.用免疫荧光法评估POSTN作用后对人SCs中OCT4表达的影响,并通过Ki67染色检测POSTN作用对人SCs增殖情况的影响。此外,用MTS和Real-time PCR方法检测POSTN对人SCs增殖情况的影响。3.POSTN与人SCs共培养,Western Blot检测POSTN作用后Wnt通路下游作用蛋白GSK3β、β-catenin和Cyclin-D1的表达情况。4.人SCs体外增殖后采用三维培养法进行体外分化,分化后利用Real-time PCR、Western Blot和免疫荧光法检测POSTN作用后SCs中单倍体分子标志物表达的变化。结果:一、HAMSCs-CM促进SCs和GC-1 spg细胞增殖1.原代分离得到hAMSCs,体外培养至第二代后可向成骨、成脂和成软骨细胞分化。流式细胞术鉴定hAMSCs细胞表面标志物的结果显示,CD73、CD44、CD105表达阳性,HLA-DR、CD31、CD45表达阴性,以上都符合hAMSCs特性。2.MTS实验结果显示,随着培养液中hAMSCs-CM浓度的升高,SCs的增殖能力变强,100%hAMSCs-CM组和75%hAMSCs-CM组与对照组相比,从24小时开始SCs细胞增殖明显增强,差异有统计学意义（p<0.05）。3.MTS实验结果表明,随着hAMSCs-CM浓度的升高,培养液促进GC-1 spg细胞增殖的能力逐渐增强,从48小时开始,100%hAMSCs-CM组和75%hAMSCs-CM组与对照组相比细胞增殖均显著增强,差异有统计学意义（p<0.05）。EdU染色结果也显示,100%hAMSCs-CM组和75%hAMSCs-CM组EdU阳性细胞所占比例显著高于对照组（p<0.05）。4.通过生物信息学分析,筛选出hAMSCs-CM中POSTN、THBS1两种蛋白高表达,可能与细胞增殖有关。5.ELISA检测结果证实,hAMSCs-CM中POSTN、THBS1表达量很高,与蛋白质谱分析结果一致。二、HAMSCs外分泌蛋白POSTN促进GC-1 spg细胞增殖1.MTS实验结果表明,100ng/m L和200ng/m LPOSTN与GC-1 spg细胞共培养后,从48小时开始GC-1 spg细胞增殖显著增强。不同浓度THBS1与GC-1 spg细胞共培养至96小时,与对照组相比细胞增殖无显著差异。EdU染色结果也显示,100ng/m L和200ng/m LPOSTN与GC-1 spg细胞共培养后EdU染色阳性细胞所占比例显著增加（p<0.05）。后续实验选择100ng/m L作为POSTN的作用浓度。2.Real-time PCR结果显示,两个siRNA序列均有效降低POSTN在m RNA水平上的表达量。而且,POSTN用siRNA干扰后,hAMSCs-CM中POSTN含量显著降低（p<0.05）。3.MTS实验结果显示,采用si-POSTN处理后收集的CM与GC-1 spg细胞共培养,与对照组相比细胞增殖能力降低（p<0.05）。此外,si-POSTN处理后的CM作用于GC-1 spg细胞,EdU染色阳性细胞比例减少（p<0.05）。4.MTS检测结果表明,用Wnt通路抑制剂XAV939预处理后,XAV939+POSTN组与POSTN组相比,细胞增殖显著减少（p<0.05）。EdU染色结果也显示,XAV939+POSTN组与POSTN组相比,阳性细胞比例显著降低（p<0.05）。5.Western Blot检测结果显示,POSTN作用于GC-1 spg细胞后Wnt通路下游信号分子GSK3β表达量下降,β-catenin和Cyclin-D1的表达量上升。6.POSTN作用组GC-1 spg细胞周期中S期细胞所占比例显著高于对照组。7.POSTN作用组与对照组相比,凋亡细胞所占比例降低。三、POSTN促进人SCs增殖1.原代分离人SCs,免疫荧光结果显示OCT4、PLZF表达阳性,RT-PCR结果显示OCT4、PLZF、SALL4、VASA表达阳性。2.Ki67免疫荧光染色结果表明,POSTN对人SCs增殖有促进作用。MTS和Real time-PCR检测结果进一步证实POSTN对人SCs增殖有促进作用。3.Western Blot检测POSTN作用于人SCs后Wnt通路下游信号分子GSK3β、β-catenin和靶基因Cyclin-D1表达量的变化,在POSTN作用后GSK3β表达量下降,β-catenin和Cyclin-D1表达量上升。4.POSTN作用后用三维培养法对SCs进行分化培养,分化后Real time-PCR检测结果显示,POSTN组与对照组相比,单倍体细胞分子标志物CREM-1、LDH、BOULE和PROTAMINE在RNA水平上的表达量增加;Western Blot和免疫荧光结果也显示,POSTN组单倍体细胞分子标志物Acrosin和TNP1在蛋白水平上的表达量高于对照组。结论:hAMSCs-CM促进SCs细胞增殖。对hAMSCs-CM进行生物信息学分析,筛选出与细胞增殖相关的hAMSCs外分泌蛋白POSTN。POSTN通过激活Wnt信号通路促进SCs细胞体外增殖,此外POSTN作用后单倍体细胞分子标志物表达量增加。