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棕榈树过氧化物酶稳定性极高,目前在食品工业上的应用越来越多。学术界对这类过氧化物酶研究逐渐增多,但是关于风车棕榈树过氧化物酶(WPTP)的研究成果极少。本文为过氧化物酶WPTP基础性研究,重点研究了 WPTP中13个糖基化位点中的2个位点对酶特性的影响。将野生型WPTP基因优化后转入巴斯德毕赤酵母GS115中,对其进行诱导表达;再对野生型WPTP进行定点突变,即分别在WPTP基因序列的60位和144位,将天门冬酰胺(Asn,N)突变为谷氨酰胺(Gln,Q),再次转入毕赤酵母诱导表达。用MALDI-TOFMS鉴定得到的三种纯化蛋白,再进行酶活、底物特异性比较,以确定本实验研究的两糖基化位点与酶功能性质的关系。最后用同源模拟的方法,分别得出以上三个酶的三维结构模型;再将它们与底物小分子分别进行分子对接模拟,以可视化的角度研究分析两突变对酶与小分子对接的影响。取得成果如下:1.首次将野生型WPTP基因、N60Q-WPTP基因和N144-WPTP基因转入巴斯德毕赤酵母,成功得到三株重组菌:GS115/pPICZαA-WT-WPTPY、GS115/pPICZαA-N60Q-WPTPY、GS115/pPICZαA-N144Q-WPTPY,并成功诱导表达出野生型和两种突变型酶,纯化后用SDS-PAGE以及MALDI-TOFMS鉴定,结果准确。2.以TMB为底物时,测得的N60Q-WPTP活性比野生型WPTP减少了 50%左右,N144Q与野生型相比活性减少将近80%,这说明N60和N144两个糖基化位点对WPTP的酶活性相当重要。野生型WPTP的N60和N144位均有糖链相连,失去糖链后,酶活性降低严重。3.用同源建模的方法首次得到WPTP分子的三维结构模型。模型显示N60位点和N144位点均在Heme活性口袋附近的位置,且N144位更近。4.结合实验结果与模拟结果可知,离活性位点更近的N144位点上所连接的糖链对底物与酶结合时起到了更大的助力作用。底物虽然不需要直接结合到血红素疏水中心,但是底物小分子还是需要通过酶分子活性口袋周围的氨基酸残基,向血红素辅基进行远程电子传递的,这时的糖链相当于酶分子展露在外的触手,帮助底物分子接近活性口袋,以更快的速度完成电子传递。本研究是棕榈树过氧化物酶的结构与功能关系的一大进展,为以后过氧化物酶分子糖基化位点作用研究提供了启示作用。