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泡桐是我国重要的速生丰产和庭院绿化树种,在生态环境改善方面起着重要的作用,同时也是制作乐器的良好材料。泡桐在我国分布广泛,然而土壤中的盐浓度对泡桐分布有限制性作用。当地下水位过高,Ph>8.0,含盐量大于0.05%则限制了泡桐在平原地区的分布。泡桐种子在发芽阶段,有一定的耐盐性,盐渍度为1%时,其发芽率仍达到70%,当盐渍度达1.6-2.5%时才没有发芽,泡桐种根及实生苗的耐盐在0.3%左右。我国的盐渍土壤面积约占可耕地面积的1/4,因此开发盐碱土成为人类增加耕地面积的重要研究方向。本研究通过对愈伤组织进行诱变处理,旨在获得能在高盐环境中生长的泡桐突变体,为盐碱地造林提供优良的泡桐品种,同时也为泡桐杂交育种提供具有优良抗性基因的亲本。研究结果如下:
1、通过将豫杂一号泡桐愈伤组织与白花泡桐愈伤组织在不同浓度NaCl条件下培养,发现当愈伤组织生长环境中NaCl浓度大于0.6%时,豫杂一号泡桐愈伤组织不能生存:愈伤组织生长环境中NaCl浓度大于0.8%时,白花泡桐愈伤组织全部死亡。因此对豫杂一号泡桐进行耐盐突变体筛选的NaCl浓度为0.6%,对白花泡桐进行耐盐突变体筛选的NaCl浓度为0.8%。利用诱变剂MMS对泡桐愈伤组织进行处理时,当MMS浓度为40mg/L,处理时间为1h时,豫杂一号泡桐愈伤组织存活率为43.3%,此为对豫杂一号泡桐愈伤组织进行诱变的半致死剂量。当MMS浓度为80mg/L,处理时间为4h时,愈伤组织存活率最为51.7%,此为对白花泡桐愈伤组织进行诱变的半致死剂量。
2、选择存活率接近50%的浓度时间组合为最佳诱变剂对两种泡桐的愈伤组织进行诱变。以MMS浓度为40mg/L,处理时间为1h的诱变剂量对豫杂一号泡桐愈伤组织进行诱变处理,处理过的愈伤组织在NaCl浓度为0.6%的培养基上进行筛选,获得分化的幼苗后将其在含致死浓度NaCl培养基中连续培养5代,共获得16株豫杂一号泡桐耐盐突变体;以MMS浓度为80mg/L,处理时间为4h的诱变剂量对白花泡桐愈伤组织进行诱变处理,处理过的愈伤组织在NaCl浓度为0.8%的培养基上进行筛选,对获得幼苗经过连续5代在含致死浓度NaCl培养基中进行筛选,共获得10株豫杂一号泡桐耐盐突变体。
3、利用泡桐SSR反应体系建立时所筛选的引物对16株豫杂一号泡桐耐盐突变体及对照进行SSR-PCR扩增,电泳结果显示只有6对引物在不同植株与对照之间表现出多态性。对筛选出来的10株白花泡桐耐盐植株进行扩增,结果显示仅有3对引物扩增出多态性。因此,SSR引物在豫杂一号泡桐和白花泡桐中检测出部分植株微卫星序列发生了变异。利用NTSYS软件对豫杂一号泡桐电泳结果进行聚类分析,结果发现不同的耐盐植株与对照之间存在遗传距离不同,其中15号植株和第9号植株与对照之间的遗传距离较远。
4、通过对泡桐原有的DNA提取方法进行改进,得到了适用于泡桐AFLP分析的DNA提取方法。利用筛选出来的97对引物对豫杂一号泡桐耐盐植株进行了AFLP分析,结果表明,有16对引物在不同的植株中扩增出多态性位点。白花泡桐AFLP结果显示有25对引物在不同植株中的微卫星多态性,同时也对不同的白花泡桐耐盐突变体及对照进行了聚类分析。