分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique,MIT)是指制备对某一特定目标分子具有特异选择性的聚合物,即分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)的过程,常被形象地描绘为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。制备的MIP在空间结构和结合位点上与特定的目标分子完全匹配,所以对目标分子具有高度的选择性和特异的识别能力。MIP的高选择性、可预见性、特异识别性和高度稳定性使其在仿生传感器、酶催化剂、药物的发现与传递以及复杂体系中样品的制备分离、分析等领域中广泛应用。以MIP作为SPE柱填料用于分离、富集和分析样品的技术称为分子印迹固相萃取(Molecularly Imprinted-Solid Phase Extraction,MISPE),它是MIT与SPE联用的一种新型分离技术,不仅具有SPE富集率高、有机溶剂用量少、操作简单等优点,而且还具有MIP的特异选择性,即选择性吸附某一特定目标分子,有效地去除样品多余的杂质,因此在中药有效成分的分离富集中显示出巨大的潜力。随着计算机和分子化理论的发展,计算机模拟技术已经应用到分子印迹体系中。它为筛选针对目标化合物的理想印迹体系提供了便捷、高效的理论指引。通过计算机分子模拟辅助手段,不仅可以深入探讨MIP的分子识别机制,而且可以指导MIP的合理设计与定向制备,大大减少了实验的盲目性及不必要的浪费。本论文以齐墩果酸(OleanolicAcid,OA)为模板分子,运用计算机模拟方法筛选功能单体,通过本体聚合法制备不同的MIP,并对MIP的结构和性能进行表征和评价。选用吸附性能最佳的OA-MIP2作为SPE填料制成MISPE柱,通过优化MISPE的上样、淋洗及洗脱条件,对女贞子提取物中的五环三萜成分OA进行分离与富集。1.研究目的及内容应用计算机模拟方法优选功能单体,以齐墩果酸(OA)为模板分子,采用本体聚合法制备OA-MIPs,对其进行结构表征和吸附性能评价;将OA-MIP作为SPE吸附材料制备OA-MISPE柱,用于分离富集女贞子粗提物中的OA,建立分子印迹固相萃取技术选择性分离和富集中药粗提物中的有效成分的方法。(1)计算机模拟优选功能单体;(2)OA-MIPs 的制备;(3)OA-MIPs的结构表征及性能评价;(4)MISPE富集女贞子提取物中的齐墩果酸。2.方法2.1计算机模拟优选功能单体(1)运用计算机模拟软件Hyperchem(?)7.5通过分子力学MM和PM3半经验法优化,分别模拟了 OA及酸性单体甲基丙烯酸(MAA)、中性单体丙烯酰胺(AM)和碱性单体4-乙烯基吡啶(4-VP)三种功能单体的最低能量构象,并计算了各自的电荷分布,根据其电负性特征采用AmberMM方法进行OA-功能单体的虚拟结合,经运算后获得OA-功能单体复合物的最低能量构象,分析了 OA-功能单体之间的氢键作用并计算了各自的单点能Epolymer、Efonction、Etemplate及结合能△E(kcal/mol),以结合能大小为指标,分析单体与模板分子间的作用力及作用机制,并且推测最优功能单体;2.2 OA-MIPs的制备及性能评价(1)采用本体聚合法,以OA为模板分子,分别以酸性的MAA、中性的AM及碱性的4-VP为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂,偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,制备三种不同的OA-MIPs,并进行动力学吸附实验、等温吸附实验,分析评价其吸附性能及印迹结合机制;(2)采用扫描电镜、红外光谱、比表面积分析等手段,以表观形貌、比表面积、孔径分布及特征吸收峰为指标,对吸附性能最优的OA-MIP进行形貌及结构的表征。2.3 OA-MIP在齐墩果酸分离中的应用。(1)将OA-MIP装填于SPE柱中制备OA-MISPE柱,以淋洗液、洗脱液中OA的回收率为指标,通过优化上样、淋洗及洗脱条件,确定OA-MISPE柱的最适上样浓度、淋洗及洗脱溶剂;(2)将女贞子粗提物上样于OA-MISPE柱,通过优化的上样、淋洗和洗脱条件进行SPE实验,测定淋洗液、洗脱液中OA的回收率,选择性地分离和富集女贞子粗提物中的OA。3.结果3.1计算机模拟优选功能单体选用酸性、中性和碱性3种常用的单体作为制备OA-MIP的功能单体,运用模拟软件Hyperchem(?)7.5模拟出OA-MAA、OA-AM以及OA-4-VP的最低能量构象及三种模板分子-功能单体复合物的结合能,以及单体和模板各自拆分后的单点能,计算复合物的结合能大小:△E(OA-AM)>△E(OA-4-VP)>△E(OA-MAA),分别为△ E(OA-AM)=-7.42(kcal/mol)、△ E(OA-MAA)=-3.53(kcal/mol)、△E(OA-4-VP)=-4.50(kcal/mol)。3.2 MIP的制备运用本体聚合法分别以OA为模板分子,EGDMA为交联剂,AIBN为引发剂制备3种MIPS(MIP1(MAA)、MIP2(AM)、MIP3(4-VP),确定制备工艺的材料配比:模板分子OA为0.1 mmol,酸性MAA、中性AM和碱性4-VP功能单体分别为1.6 mmol,交联剂 EDMA 为 8.0 mmol。3.3 OA-MIP的性能评价通过动力学曲线分析,OA-MIP1、OA-MIP2和OA-MIP3在吸附的初始阶段,对OA的吸附量分别为57.2 μmol/g、157.3 μmol/g和44.9 μmol/g;随着吸附时间的增加,OA-MIP1在20 min内达到吸附峰值75.4 μmol/g,而OA-MIP2和OA-MIP3分别在2 h和8 h内吸附达峰,Q值分别为273.0 μmol/g和145.3 μmol/g;随着吸附时间的继续增加,三种MIP对OA的吸附量都下降并趋于平缓。静态吸附曲线显示,OA-MIPs与NIPs的吸附量均随模板分子浓度的增加而增加,而且OA-MIPs对OA的吸附量明显高于NIPs。当OA的浓度分别达3 mmol/L、4.0 mmol/L、3.5 mmol/L 时,OA-MIP1和 NIP1、OA-MIP2和 NIP2及 OA-MIP3和NIP3对其的吸附量基本趋于稳定,达到平衡,三组OA-MIPs和NIPs的最大吸附量 Qmax分别为 141.71 μmol/g 和 114.20 μmol/g、280.98 μmol/g 和 217.17μmol/g 及 232.18 μmol/g 和 186.64 μmol/g。其中 OA-MIP2 和 NIP2 的 Qmax 最大,其次为OA-MIP3和NIP3,最小的为OA-MIP1和NIP1。3.4 OA-MIP的结构表征对选择吸附性能最佳的OA-MIP2进行SEM、IR及BET测定。结果显示,OA-MIP2表面粗糙,充满复杂孔隙,而NIP2表面光滑,结构平整,二者的表面形貌相比具有明显的差异。由IR图可见,OA-MIP2和NIP2IR图谱非常相似,这是因为他们所含的官能团基本相同,都是由交联剂EGDMA和功能单体AM聚合构成,主要官能团为3466cm-1处-NH2的伸缩振动,1732 cm-1处的>C=O的伸缩振动,1479 cm-1处-CH3的弯曲振动。由于未移除模板分子的MIP中,AM的-NH2和>C=O与模板分子的-COOH发生相互作用,因此几乎看不到-NH2的伸缩振动,>C=O的伸缩振动也不明显。BET分析显示,MIP2的比表面积为203.5m2/g,总孔体积达到0.242cm3/g,孔径分布在17A-3000 A之间,平均孔径为47.6A,属于中孔结构。3.5 OA-MISPE在齐墩果酸分离中的应用(1)以OA对照品溶液上样OA-MISPE柱,以OA的回收率为指标,对上样、淋洗和洗脱条件进行优化,最终确定以0.5 mL 1.0 mg/mL的OA对照品溶液上样,0.5mL甲苯淋洗,2mL×2的甲醇洗脱,为OA-MISPE柱的固相萃取最优条件。(2)建立了 MISPE测定OA含量的方法:OA标准液的标准方程为:y=7944.1x-179.39(r2=0.9991),在 0.2 mg/mL～1.4 mg/mL 范围内线性关系良好;精密度≤0.28%;OA在女贞子粗提物中的相对回收率为95.9%-84.3%,RSD为 1.47%-2.39%之间。(3)女贞子粗提物上样于MISPE柱中,通过优化的OA-MISPE上样、淋洗和洗脱条件,对女贞子粗提物中的OA进行分离富集,结果OA的富集率可达 76.0%。4.结论4.1采用Hyperchem(?)7.5通过分子力学MM、PM3半经验法和AmberMM方法进行模板分子齐墩果酸(OA)与功能单体的虚拟结合,经运算后获得复合物结合能分别为△ E(OA-AM)=-7.42(kcal/mol)、△ E(OA-MAA)=-3.53(kcal/mol)、△E(OA-4-VP)=-4.50(kcal/mol),其中OA-AM形成的复合物结合能大,且在OA羧基处形成了双氢键的稳定六元环状结构,与只能形成一个氢键的OA-MAA和OA-4-VP复合物相比,更易形成稳定的印迹聚合物体系。因此,中性的功能单体AM与酸性模板分子OA的分子印迹组合最佳,碱性功能单体4-VP次之,而酸性功能单体MAA与OA结合力最弱。4.2.采用本体聚合法,以AM、MAA和4-VP为功能单体合成了 OA-AM、OA-MAA和OA-4-VP三种MIP,吸附动力学和静态吸附实验表明,OA-MIP2的吸附量最大,达280.98 μmol/g,分别为MIP1和MIP3的2倍和1.2倍。SEM及孔径分析显示,聚合物表面粗糙多孔,表面积增大。以上结果表明,以AM为功能单体制备的OA-MIP2与OA-MIP1、OA-MIP3相比,对OA具有特殊的亲和力及特异的吸附能力。三种MIP的性能评价结果验证了计算机模拟结果,即中性功能单体AM与模板分子OA能形成稳定的分子印迹聚合物体系,其MIP对模板分子具有较强的吸附选择性。说明计算机模拟方法筛选分子印迹制备过程中的功能单体,方法可行,简便有效。4.3以OA-MIP作为固相萃取(SPE)的吸附填料制备OA-MISPE柱,通过优化上样、淋洗和洗脱条件,对女贞子粗提物中的OA进行富集,结果OA的富集率可达76.0%。并建立了 MISPE法测定OA含量的方法。分子印迹固相萃取技术能选择性分离和富集中药粗提物中的有效成分。