次生维管组织是植物重要的物质运输通道,同时也为植物的根茎等组织提供必要的机械支撑,对陆生植物的生长发育起到决定性作用。次生维管组织发育起始于维管形成层干细胞。维管形成层细胞分裂是次生维管发育的主要细胞来源,而其向两侧分化则形成次生维管中主要的物质运输组织——次生韧皮部和次生木质部。因此,维持维管形成层细胞分裂与分化的稳态是保持维管组织正常有序生长的关键。维管形成层发育受到转录因子与植物激素等信号因子组成的复杂网络的精细调控。其中,TDIF/TDR信号通路通过协调其下游WOX4支路与GSK-BES支路决定维管组织模式并维持维管干细胞特性,是维管形成层发育调控网络中的核心通路。但TDIF/TDR信号通路受到哪些因子的调控目前仍不清楚。植物激素作为重要的内源信号因子在维管形成层发育过程中也扮演着重要的角色。现有研究证明,生长素主要分布于维管形成层区域,通过其下游响应因子参与维持维管干细胞活性及促进木质部的分化,是定义维管形成层组织中心的重要因子之一。此外,赤霉素、乙烯及油菜素内酯等诸多植物激素均已被报道能够影响维管形成层发育。细胞分裂素是一种直接参与细胞增殖的植物激素,是植物各分生组织维持细胞干性所必须的植物激素之一。在早期拟南芥的研究中就已证明,细胞分裂素合成受阻将导致严重的维管组织发育缺陷,说明细胞分裂素对于维管组织发育具有不可或缺的作用。而在木本植物中,细胞分裂素也已被证明参与维管形成层活性的本地调控。但次生韧皮部大量富集的细胞分裂素对维管组织发育有何功能目前仍尚未被解析,亟待深入研究。本论文以木本植物杨树为研究模型,利用免疫荧光及原位杂交等技术精确表征维管组织中细胞分裂素及其受体的分布模式。同时通过分子生物学和遗传学等多种手段,揭示了次生韧皮部细胞分裂素信号对维管形成层稳态的非细胞自主性调控作用,并深入解析其作用的分子机制。本论文主要研究结果如下:1)精确表征细胞分裂素在次生维管组织中的分布模式为了更加直观地表征细胞分裂素在次生维管组织中的分布模式,利用特异性抗体标记植物中细胞分裂素主要活性形式反式玉米素（t Z）及其前体反式玉米素核糖苷（t ZR）。通过对次生维管组织中荧光信号的定量统计,绘制出细胞分裂素在次生维管组织中的分布模式,即其浓度峰值定位于次生韧皮部,并向维管形成层方向梯度降低。2)维持细胞分裂素分布模式是次生维管发育所必须的为阐明细胞分裂素的梯度分布在次生维管组织发育中的生物学意义,选取细胞分裂素浓度峰值区域（次生韧皮部）的特异性启动子启动细胞分裂素氧化酶基因,破坏次生维管组织中细胞分裂素的分布模式。对维管形成层发育相关表型进行分析,发现在转基因植株中维管形成层细胞分裂活性显著降低,说明在维管发育过程中细胞分裂素的梯度分布模式对于维管形成层活性的维持至关重要。3)次生韧皮部存在完整的细胞分裂素信号转导通路为了探究次生韧皮部富集的细胞分裂素能否进行本地的信号转导,首先对维管组织中细胞分裂素受体分布进行检测。通过原位杂交等技术,确定了在次生韧皮部与维管形成层中均含有细胞分裂素受体的转录本。进一步检测破坏细胞分裂素分布模式的转基因植株（pro CLE41b::At CKX2）次生韧皮部中细胞分裂素信号响应标记A型RR基因的表达水平均出现显著下调,证明在次生韧皮部区域存在完整的细胞分裂素信号转导通路。4)次生韧皮部细胞分裂素信号非细胞自主性调控维管形成层稳态为揭示次生韧皮部细胞分裂素信号对次生维管组织的调控作用,建立了次生韧皮部特异性启动子介导干扰/增强细胞分裂素信号的转基因植株（pro CLE41b::HK-RNAi和pro CLE41b::RR13）。表型分析发现,转基因植株中的维管形成层细胞分裂活性及向次生木质部的分化均出现明显变化。而在干扰韧皮部细胞分裂素信号的转基因背景下,再改变细胞分裂素的含量将不会造成更加严重的表型。这说明次生韧皮部的细胞分裂素信号依赖于本地信号转导通路非细胞自主性调控维管形成层稳态。5)初步筛选次生韧皮部细胞分裂素信号的下游靶基因为解析次生韧皮部细胞分裂素信号调控维管形成层稳态的分子机制,利用转录组分析野生型及细胞分裂素信号变化转基因植株差异基因,并结合已公开的杨树次生维管组织相关RNA-Seq数据库Asp Wood进行筛选。初步确定特异性在韧皮部表达且受到细胞分裂素诱导的可移动因子DOF家族转录因子和CLE家族CLE41/44基因为次生韧皮部细胞分裂素信号的潜在靶基因。6)细胞分裂素信号的诱导潜在靶基因DOF和CLE41/44的表达为更加准确地验证细胞分裂素信号对DOF家族转录因子和CLE家族CLE41/44基因的诱导作用,检测了特异性干扰次生韧皮部细胞分裂素信号及外源细胞分裂素处理株系中两类基因的转录水平。荧光定量PCR结果显示两类次生韧皮部细胞分裂素信号的潜在靶基因均响应于细胞分裂素信号的变化。同时,建立细胞分裂素响应因子B型RR过表达载体（35s-RR13）,利用效应子报告系统（Effectorreporter）确定细胞分裂素信号可以通过B型RR转录因子激活DOF家族转录因子和CLE41/44基因的转录活性。7)次生韧皮部细胞分裂素信号潜在靶基因DOF和CLE41/44编码蛋白能够在次生维管组织细胞间移动为验证筛选得到的次生韧皮部细胞分裂素信号潜在靶基因所编码蛋白是否能够在次生维管组织细胞间移动,首先建立了DOF家族转录因子DOF35和CLE41/44基因CLE41b启动子连接报告基因的转基因株系（pro DOF35-GUS和pro CLE41be YFP-TMC）,确定其转录起始位置均在次生韧皮部。同时,构建DOF35启动子启动DOF35-e YFP融合蛋白转基因植株,并通过特异性抗体对次生维管组织中CLE41/44基因编码的TDIF小肽进行标记,最终确定了次生韧皮部细胞分裂素信号的潜在靶基因所编码蛋白均能够自转录起始的次生韧皮部移动至维管形成层区域。8)细胞分裂素信号直接结合CLE41/44基因的启动子进而促进其转录激活为确定细胞分裂素是否直接调控DOF家族转录因子和CLE家族CLE41/44基因的转录,通过蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理排除细胞分裂素借助其他蛋白调控下游靶基因的可能。细胞分裂素处理后荧光定量PCR检测结果显示仅有CLE41/44基因依然受到细胞分裂素的诱导。同时,染色质免疫共沉淀（CHIP）分析也发现仅在CLE41/44基因的启动子区域存在细胞分裂素响应因子B型RR直接结合的位点。进一步通过以萤火虫生物素荧光酶介导的效应子报告系统（Effectorreporter）再次验证了CLE41/44基因的启动子中细胞分裂素响应因子B型RR直接结合位点突变后,其不在受到B型RR转录因子的诱导。这些结果表明,细胞分裂素信号能够通过B型RR转录因子直接调控CLE41/44基因的转录,而对DOF家族转录因子的诱导可能是一种间接作用。9)CLE41/44基因所编码的TDIF小肽介导次生韧皮部细胞分裂素信号对维管形成层稳态的非细胞自主性调控上述实验已经确定细胞分裂素信号能够直接调控CLE41/44基因的转录,通过特异性抗体检测特异性干扰次生韧皮部细胞分裂素信号的转基因植株（pro CLE41b::HK-RNAi）中TDIF小肽分布模式并未有明显变化但积累水平显著降低。同时建立CLE41/44基因CLE41b原位过表达载体（pro CLE41b::CLE41b）,通过遗传转化技术转入干扰细胞分裂素信号的转基因植株（pro CLE41b::HK-RNAi）中。维管组织发育相关表型观察发现CLE41b基因的原位过表达恢复了次生韧皮部细胞分裂素信号被干扰造成的维管形成层发育缺陷,且维管形成层稳态维持关键基因表达水平也上调至野生型水平,说明CLE41/44基因所编码的TDIF小肽介导了次生韧皮部细胞分裂素对维管形成层稳态的非细胞自主性调控。综上所述,本研究揭示了定位于次生韧皮部的细胞分裂素信号能够以非细胞自主性的方式调控维管形成层干细胞稳态。其中,次生韧皮部细胞分裂素信号主要通过直接诱导可移动的信号因子TDIF小肽在次生维管组织中的积累,进而参与维管形成层细胞分裂及次生木质部分化的调控过程。