在对树突状细胞(dendritic cell，DC)cDNA文库进行大规模测序的过程中，我们发现了许多新的与免疫功能和基本生命调控密切相关的全长基因。本研究拟对已经进行初步研究的新型小GTPase RabJ进行进一步的功能及其作用机制研究。RabJ的全长cDNA来源于树突状细胞，包含822 bp的开放阅读框，编码273个氨基酸的蛋白质，在人睾丸组织中呈优势表达，在人肿瘤细胞系中有广泛的表达。以前的研究提示其主要定位于细胞核，可以和热休克蛋白(heat shock protein，HSP)HSC70结合。但是其确切的生物学功能仍然未知。经过深入的研究和探讨，我们证明并推测RabJ可能参与对细胞增殖、细胞周期调控、肿瘤发生等细胞生物学功能的调控。 首先，我们利用RT-PCR、免疫组化等方法进一步确认了RabJ的细胞和组织分布的特点。利用多种细胞系和小鼠组织的总RNA，通过RT-PCR方法研究发现，RabJ是一个分布比较广泛的分子，在HeLa、Jurkat、Molt-4、NB4、THP-1、U937、MCF-7、PC-3等多种人源造血细胞系白血病细胞和实体瘤内均有较高的表达；在小鼠细胞系A20、EL-4、P815、B16、3LL内均有不同程度的表达，在小鼠的正常细胞系3T3和骨髓基质细胞系TC-1内却没有表达；在C57BL／6小鼠睾丸、卵巢、肾脏、脾脏、大脑、胃、结肠和骨骼肌等组织内有不同程度表达，在胸腺、肝脏、心脏、肺内却没有表达。在小鼠睾丸组织内，RabJ主要分布于初级精母细胞和早期精子细胞内，在支持细胞Sertoli、间质细胞Leydjg细第二军医大学博士学位论文新型癌基因样小G蛋白RabJ胞和成熟精子细胞内没有表达。这种分布模式与细胞周期蛋白卿ClinO和CyclinE在辜丸组织中的表达模式非常接近。因此，RabJ的表达分布模式强烈提示其与细胞增殖和细胞分化密切相关。 然后，我们研究了RabJ的亚细胞定位。对RabJ的蛋白质序列进行进一步的分析，我们发现在其氨基端18个氨基酸片段内含有两个富含碱性氨基酸的区域，与描述的细胞核定位信号(nuelear loealization signal，NLS)Lys一Ar以Lys一X-Ar以Lys非常类似。因此，RabJ在结构上可以分成三个功能域:NLS(1一18)、Rab(19一208)和J(209一273)功能域。我们构建T RabJ的突变体，包括RabJ(1一273)、RabJ(1一208)、RabJ(19一208)、RabJ(209一273)和RabJ(，9一273)。应用瞬时表达和共聚焦显微镜技术，我们发现在NIH3T3细胞内，外源瞬时表达的全长RabJ主要位于细胞核内;去除NLS或者J功能域后，RabJ失去核定位特征，提示其细胞核定位的特性取决于NLS或者J功能域。利用亚细胞分离的生化方法和Weatem技术，我们发现在表达RabJ的宫颈癌HeLa和乳腺癌MCF-7细胞内，内源性RabJ也主要位于细胞核内。应用RabJ多克隆抗体并结合共聚焦显微镜技术和免疫电镜技术，我们发现内源性Ra国主要分布于细胞核内。因此，RabJ是一个定位于细胞核的GT户ase，其氨基端18个氨基酸部分可能起到NLS的作用。 为了证明RabJ与细胞增殖的关系，我们构建了全长RabJ和结构缺失突变体，包括hRabJ(1一273)、hRabJ(1一208)、hRabJ(209一273)、hRabJ(19一208)、hRabJ(19一273)。在RabJ阴性表达的NIH3T’3细胞内转染上述载体，使用新霉素(600一100。尸以m!)连续筛选3周，经过有限稀释，建立了稳定表达细胞系。我们用护Hl一TdR掺入法，观测了细胞增殖的速率。我们发现在稳定表达Ra目全长和J功能域的的NIH3T3和HeLa细胞系内，细胞的增殖速率明显增加。在低血清浓度(0.5%)情况下，过表达RabJ的NIH3T3细胞和HeLa细胞增殖速率 5第二军医大学博士学位论文新型癌基因样小G蛋白R山」分别达到30一50倍(NIH3T3)和8一15倍(HeLa)，单独Rab功能域也有类似的作用，但是较弱。而且RabJ表达后可以促进NIH3T3细胞细胞周期向GZIM和S期进展。在含有0.5%血清的培养平板中，稳定表达hRabJ、mRabJ、RabJ (209一273)和R曲J(1一208)的NIH3T3细胞均可以形成焦点(foeus)。在HeLS细胞内，RabJ也可以促进细胞形成焦点，单独J功能域可以促进焦点的形成。为了检测细胞接触非依赖性生长的能力，我们在软琼脂培养平板上，观察了细胞克隆的形成。我们发现Ra匕J可以促进少数NI日3T3克隆形成，提示RabJ可以使少数NI日3T3细胞发生转化(下ransformation)，RabJ可能是一个潜在的癌基因(。ncogene)。在裸鼠体内接种稳定表达全长人或小鼠源RabJ的NIH3T3细胞，发现可以形成肿瘤样结节，而表达对照载体以及单独表达Rab或J功能域的NIH3T3和野生型 NIH3T3细胞则不能，提示RabJ的两个功能域对于RabJ的致瘤效应是必须的。经过苏木素一伊红染色，我们发现肿瘤结节的病理类型是成纤维细胞肉瘤，表现为纤维状细胞成旋涡状排列、核浆比例增大、大面积的缺血性坏死和众多出现核异型性的细胞。因此，我们认为在体内Ra国也可以使NIH3T3细胞出现致瘤性。使用RNA干扰和反义寡核昔酸技术阻断RabJ在RabJ阳性表达的HeLa和MCF一7细胞系内的表达，可以抑制这两种肿瘤细胞的增殖、焦点形成、致瘤性、和?