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目的 随着糖尿病发病率的逐年升高，糖尿病的合并症——糖尿病肾病所导致的肾功能衰竭威胁着越来越多的人群，我们的工作皆在研究糖尿病肾病的发病机制，从根本上阻断其进展的关键环节从而达到治疗该病的目的。目前的研究表明，核因子-κB(NF-κB)在免疫、炎症、缺血、硬化等相关疾病中发挥重要的作用，该因子引领糖尿病肾病发病机制的研究进入了一个崭新的阶段。正常状态下，NF-κB存在于肾小球细胞的胞浆中，当受到外来信号刺激时被活化，由胞浆移位至胞核，参与调控免疫反应、炎症反应、细胞生长和粘附，导致肾脏功能及组织学异常。本研究通过测定糖尿病肾病发病不同时期大鼠肾损害情况，用免疫组织化学染色检测NF-κB P65和其抑制蛋白κB-α(IκB-α)在其肾小球的表达，明确糖尿病肾病发病不同时期NF-κB的活化程度，运用医学统计学分析活化程度与糖尿病肾病肾损害的相关性，推断NF-κB在糖尿病肾病发病机制中的作用。 材料与方法 一、动物模型制备 150-170g雄性sprague-dawley(SD)大鼠96只，随机分为正常对照2周、4周、12周及糖尿病大鼠2周、4周、12周组，每组16只。腹腔注射链脲菌素(STZ)(60mg／kg)，2天后血糖≥13.9mmol／L的大鼠为糖尿病大鼠，正常对照组注射同等剂量的生理盐水。所有大鼠均自由饮水摄食，分别于糖尿病发病2周、4周、12周时测体重，用代谢笼收集24小时尿液，在戊巴比妥(50mg／kg)腹腔注射麻醉下腹主动脉末端插入导管，采血后进行原位肾脏灌洗，留取肾脏标本进行福尔马林固定、石蜡包埋。 二、生化检测： 24小时尿蛋白定量采用磺柳酸硫酸钠比浊法，以牛血清白蛋白为标准蛋白，血糖采用葡萄糖氧化酶法，血肌酐采用苦味酸法用全自动生化分析仪检测并计算Ccr。 三、病理学检查 采用ABC法对石蜡标本进行免疫组化染色，检测肾组织中NF一KB P65、IKB一a的表达。 1.取5林m的石蜡切片脱蜡至水; 2.3%HZoZ室温处理10分钟; 3.采用高压热修复进行抗原修复2 .5分钟; 4·10%正常山羊血清封闭; 5.滴加兔抗鼠p65(l:100)、IKBa(1:100)一抗4℃湿盒过夜，以PBS代替一抗做阴性对照; 6.加生物素化羊抗兔IgG37℃20分钟; 7.滴加ABC37℃20分钟; 8.DAB显色;苏木素复染;系列酒精脱水、透明、封片，镜下观察。 9.用双盲法计数每个肾小球横截面中的阳性细胞数，每张片子计数10至巧个肾小球，细胞内染成黄棕色部位为阳性部位。 四、统计学处理: 计量资料以又土s表示，组间差异用F检验及T检验，相关分析采用线性回归，所有数据均在SPSS10.0软件上处理。结果 1.糖尿病大鼠血糖明显升高，体重减轻，肾重/体重比值增加，尿量增加;2周、4周组糖尿病大鼠Ccr比同期正常对照组高，而尿蛋白无变化;12周糖尿病大鼠Ccr与同期对照组相比差异无显著性、尿蛋白排出量显著增加(p<0.01)。符合糖尿病肾病发病不同阶段的标准。 2.在2周、4周、12周正常对照组大鼠肾小球细胞中P65主要在胞浆表达，极少在核内表达;IKB一a则在胞浆中表达。玛5和IKB一a的表达在三组间无显著性差异。 3.在糖尿病大鼠2周、4周、12周组肾小球细胞中P65核内表达明显高于相应的正常对照组(p<0.05)且随糖尿病的进展表达呈递增趋势(p<0.01);P65核内表达水平与尿蛋白量呈正相关(r=0.854，p<0.05)，与肾小球内细胞总数呈正相关(r=0.686，p<0.05)。 4.在糖尿病大鼠2周、4周、12周组肾小球细胞中IKB一a在胞浆表达明显弱于同期正常对照组(p<0.05)且随糖尿病的进展表达呈递减趋势(p<0.01);IKB一a胞浆表达的水平与尿蛋白量呈负相关(r二一0.684，p<0.05)，与肾小球内细胞总数呈负相关(r二一0.294，p<0.05)。 5.糖尿病2周、4周到12周大鼠的肾小球细胞中P65核内表达与IKB-。胞浆表达呈负相关(r二刃.960，p<0. 05)。讨论 糖尿病肾病的发生除高糖因素外，，存在一种具有中心调节作用的因子，因此我们检测了NF一KB P65和IKB一a在糖尿病肾病不同发展阶段肾小球的表达，以正常大鼠肾组织做对照。正常时NF一KB以巧0一P65一IKBa存在于胞浆中，当受到细胞外来信号刺激时IKBa降解，p65移位至胞核，完成活化。本实验结果显示，正常大鼠肾小球P65在系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞的胞浆中表达，极少在胞核表达;IKBa则在胞浆表达。糖尿病肾病时玛5在上述细胞及浸润的炎性细胞的核内表达明显高于同期正常对照组;IKBa胞浆表达明显弱于同期正常对照组。正常时NF一KB处于非活化状态，糖尿病状态下由于PKC活化、TNF一a和IL一1增多、肾脏局部Ang一n浓度增加，这些因素均可使IKBa降解、P65进人核内即NF一KB活化。本实验结果还显示随P65核内表达的阳性细胞数逐渐增多和IKBa胞浆表达的阳性细胞数逐渐减少糖尿病大鼠的尿蛋白逐渐增多，这说明随NF一KB活化增强糖尿病肾损害在进展。该结果可能有以下解释:PKC活性随糖尿病病程延长逐渐增强;TNF一a和IL一1即能活化NF一KB又能因NF一KB活化而产生增加，形成正反馈使NF一KB活化