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目的:外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡,是细胞间遗传物质传递的新载体,其在肿瘤标志物、癌症治疗、以及组织再生等多种病理和生理过程中起到了关键作用。脱落乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)是一种具有高增殖、多潜能分化能力且容易获得的干细胞,其来源的细胞外囊泡如外泌体研究较少。因此,本研究利用人脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体(SHED-Exos)探究其在牙周炎小鼠体内的成骨效果和调节骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外成骨分化能力,为脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体促进骨再生提供研究参考。方法:1.外泌体收集:SHED培养至第4-7代,收集细胞培养液,采用30%蔗糖垫超速离心法提取SHED-Exos,使用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察SHED-Exos的形态特征,利用蛋白质印迹法(Western blot)对表面标记物CD63进行鉴定;2.BMSCs培养及生物学特性检测(1)骨髓间充质原代细胞取自10月龄小鼠股骨和胫骨,传代到第1代和第2代(P1-P2),观察细胞形态及多向分化能力;(2)将BMSCs与磷酸盐缓冲液(Phosphate balanced solution,PBS)、SHED-Exos(1μg/ml)和SHED-CM(Conditional medium,CM)共培养,利用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测各处理组BMSCs增殖能力。我们利用5μM喜树碱诱导BMSCs细胞凋亡,通过不同处理、利用流式细胞术检测细胞凋亡变化;(3)为了检测BMSCs成骨水平的情况,将PBS、SHED-Exos、SHED-CM分别加入成骨诱导培养基中培养BMSCs,成骨诱导3天后,通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测ALP、Runx2成骨基因表达;成骨诱导7天,利用对硝基苯基磷酸酯溶液(p-Nitrophenyl Phosphate,p-NPP)检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性;成骨诱导14天,通过q RT-PCR检测Runx2、Osx成骨基因表达,茜素红染色观察矿化结节形成,并使用氯化十六烷基吡啶溶液进行定量,利用Western blot检测Runx2蛋白翻译水平差异;(4)将PBS、SHED-Exos、SHED-CM分别加入成脂诱导培养基中,再通过q RT-PCR检测成脂基因过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)的表达水平情况;显微镜下观察不同处理组脂滴生成差异并进行定量分析;(5)利用1μg/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激BMSCs 24小时,以诱导促炎症相关基因的表达。同时加入PBS、SHED-Exos(10μg/ml或1μg/ml)、SHED-CM与BMSCs共培养24小时,通过q RTPCR检测促炎症因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平差异。3.牙周炎模型建立:选取10月龄小鼠,在小鼠上颌第一磨牙周围利用5-0丝线进行牙周结扎,14天后去除结扎线,同期在第一磨牙牙周颊、腭侧局部注射PBS或SHED或SHED-Exos,每周注射一次,两周后对小鼠上颌进行取材,通过微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Micro CT)扫描,进行3D重建,分析第一磨牙颊、腭侧骨再生情况,并测定近、远中釉牙骨质界(Cementum-enamel junction,CEJ)到牙槽骨嵴顶(Alveolar bone crest,ABC)距离,通过组织学切片,进行HE和Masson染色观察新生骨质情况;结果:1.SHED细胞培养至P4-P7代,细胞呈大小均匀的长梭形或纺锤状形态,利用超高速离心法提取的SHED-Exos,使用TEM观察提取的外泌体为直径100nm左右的球状膜包裹结构,Western blot显示CD63表达阳性;2.为了进一步探寻外泌体对于骨髓间充质干细胞/基质细胞的生物学调控作用,我们从10月龄小鼠胫骨和股骨骨髓内分离并培养骨髓来源间充质干细胞。培养至P1-P2代的细胞呈梭形并且可向成骨成脂方向分化,用于后续实验。SHED-Exos可促进BMSCs增殖,无明显抑制早期凋亡作用。成骨诱导3天后,SHED-Exos对成骨基因ALP和Runx2未见明显诱导作用;成骨诱导7天后,SHED-Exos增强碱性磷酸酶(ALP)活性,逐渐发挥成骨作用;成骨诱导14天后,SHED-Exos增强矿化结节形成,Runx2基因表达和蛋白表达水平增强,同时Osx基因表达显著增强,促进BMSCs向成骨细胞分化,因此,SHED-Exos可以特异性促进BMSCs成骨分化。成脂诱导分化14天后,油红O染色和定量结果表明SHED-Exos减弱BMSCs脂滴生成能力,q RTPCR结果表明SHED-Exos抑制成脂诱导基因PPARγm RNA表达,以上结果表明SHED-Exos抑制BMSCs成脂分化。1μg/ml脂多糖(LPS)诱导24小时后,q RT-PCR结果表明1μg/ml SHED-Exos可以抑制BMSCs IL-6和TNF-αm RNA表达,而高浓度的外泌体(10μg/ml SHED-Exos)相反促进IL-6和TNF-α表达;3.为探究外泌体对于骨丢失的体内成骨作用,在10月龄小鼠上颌第一磨牙周围利用丝线结扎诱导牙周炎,结扎14天后,第一磨牙颊、腭侧可见明显的骨丢失。同期在第一磨牙牙周颊、腭侧局部注射PBS或SHED或SHEDExos,2周后,Micro CT分析硬组织量和进行组织学染色(HE及Masson染色)结果均表明SHED-Exos可以明显促进牙周炎后的骨再生,外泌体组可以达到和源细胞治疗相似的成骨效果,同时可以观察到明显的牙周膜形成。结论:以上实验证明,脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体可以定向促进骨髓间充质干细胞的成骨分化能力、抑制成脂分化能力;同时促进细胞的增殖能力。此外,外泌体可以抑制LPS诱导的炎症因子的上调。在动物模型中,我们利用牙周炎模型再次验证了,脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体促进牙槽骨修复和再生。因此,脱落乳牙牙髓干细胞来源的外泌体有望成为一种新型的促进骨再生的治疗策略。