脑缺血、脑外伤等脑损伤性疾病，是发病率、致残率和致死率均高的中枢神经病变，故对脑缺血、脑外伤等损伤/抗损伤机制的研究，探索其防治措施，有重要的意义。在过去的15～20年，越来越多的证据表明，神经兴奋性毒性对神经元缺失所起的作用是最主要的发病机制之一，其中，N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体在介导急性谷氨酸兴奋性毒性中起到关键性作用，NMDA受体拮抗剂的应用能降低实验动物缺血性脑损伤中的神经元死亡。白三烯类（leukotrienes，LTs）是花生四烯酸经5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）代谢产生的一族脂类炎性介质。LTs包括白三烯B₄（LTB₄）以及半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs，包括LTC₄、LTD₄、LTE₄）。CysLTs通过激活半胱氨酰白三烯受体（包括CysLT₁和CysLT₂受体），参与多种炎症病理过程，介导平滑肌痉挛、微血管渗漏等反应。这两种受体（CysLT₁和CysLT₂受体）已相继被克隆。它们均为经典的G蛋白偶联7次跨膜受体，与Gq蛋白偶联。很多CysLTs受体拮抗剂也相继被开发，如孟鲁司特（montelukast）、普鲁司特（pranlukast）等。早期，CysLT₁和CysLT₂受体研究主要集中在外周组织，如呼吸系统等外周疾病。近几年来的研究表明，CysLT₁和CysLT₂受体也在中枢神经系统表达，可能参与脑缺血、脑外伤和脑退行性疾病等中枢疾病。脑缺血后，脑内5-LOX表达增加、活性增高，其代谢产物CysLTs显著增加；CysLT₁和CysLT₂受体也被诱导表达。我们实验室也发现，CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特可保护实验动物的脑缺血性损伤。而且，在脑外伤和脑肿瘤病人的神经元样和胶质样细胞，CysLT₁和CysLT₂这两种受体均可诱导表达。目前，已有研究证明脑缺血时，CysLTs浓度一时性增高，并且该作用与NMDA受体激活有关。然而，还没有直接证据显示CysLT₁和CysLT₂受体在兴奋性毒性中的作用。尚未阐明，CysLT₁和CysLT₂受体在神经元中是否有表达?是否直接参与了神经元的兴奋性毒性损伤?本研究拟建立小鼠皮层直接注射NMDA诱导脑兴奋性毒性损伤模型，并阐述上述问题。同时，在另一种实验动物脑损伤模型—小鼠脑冷冻伤模型上，观察CysLT₁受体的表达特征，以及CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特对脑冷冻伤的治疗时间窗。第一部分小鼠NMDA诱导脑损伤后脑内半胱氨酰白三烯受体1表达增加介导神经元损伤兴奋性毒性在脑损伤中起关键性作用；半胱氨酰白三烯（CysLTs）及其受体（CysLT₁受体）也参与脑损伤病理过程。但两者间的关系尚无直接证据证明。为研究CysLT₁受体在兴奋性毒性脑损伤中的作用，首先建立了皮层直接注射NMDA（50～150nmol，0.5μl）诱导兴奋性毒性脑损伤模型。观察NMDA注射24h后，CysLT₁受体在脑内的表达情况；同时观察了CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特（0.01和0.1mg/kg）、NMDA受体拮抗剂氯胺酮（30mg/kg）及自由基清除剂依达拉奉（9mg/kg）的作用。我们发现，NMDA诱导脑损伤后，CysLT₁受体的mRNA和蛋白表达上调；并且，免疫双标染色结果显示，CysLT₁受体诱导表达于损伤区的神经元。普鲁司特、氯胺酮和依达拉奉对NMDA诱导脑损伤具有保护作用。普鲁司特（0.1mg/kg）、氯胺酮能抑制CysLT₁受体表达上调。这些结果表明，CysLT₁受体可能介导NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤。第二部分小鼠NMDA诱导脑损伤后脑内半胱氨酰白三烯受体2的表达特征CysLT₂受体是最近得到克隆和鉴定的CysLT受体之一，它相对较高地表达于人脑组织，在多个脑区都有分布。在脑外伤病人脑样本中，CysLT₂受体诱导表达于神经元样细胞和胶质样细胞。为进一步研究CysLT₂受体在兴奋性毒性脑损伤中的变化，我们用RT-PCR和免疫组织化学方法，研究了小鼠NMDA诱导脑损伤后，CysLT₂受体在脑内的表达特征。RT-PCR结果显示，在损伤区CysLT₂受体mRNA在NMDA注射后24h表达上调；而非损伤的对侧脑区CysLT₂受体mRNA水平没有变化。免疫双标染色结果显示，NMDA损伤后24h，CysLT₂受体主要表达于损伤区的神经元，而不表达于星形胶质细胞。这些结果表明，CysLT₂受体在兴奋性毒性脑损伤后可能介导急性期神经元损伤。第三部分小鼠脑冷冻伤后半胱氨酰白三烯受体1的表达及拮抗剂普鲁司特时间依赖性保护作用最近，我们报道在脑外伤病人样本中，CysLT₁受体诱导表达于神经元样和胶质样细胞。为进一步研究CysLT₁受体在脑外伤中的作用，我们研究了小鼠脑冷冻伤后3h～48h，CysLT₁受体在脑内表达的时间特征；同时观察损伤后给予CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特，对小鼠脑冷冻伤的治疗作用。RT-PCR结果显示，在损伤后6h，12h和24h，损伤侧皮层CysLT₁受体mRNA表达上调，而非损伤的对侧皮层CysLT₁受体mRNA水平在48h内没有变化。免疫双标染色结果显示，脑冷冻伤后24h，CysLT₁受体主要表达于损伤周边区神经元，而不表达于星形胶质细胞。CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特，对小鼠脑冷冻伤具有时间依赖的神经保护作用，其治疗时间窗为损伤后30min。这些结果提示，CysLT₁受体介导脑冷冻伤后急性期神经元损伤；普鲁司特对脑外伤可能具有治疗作用。结论1．小鼠皮层注射NMDA诱导兴奋性毒性脑损伤后CysLT₁和CysLT₂受体表达上调。脑损伤后24h，CysLT₁和CysLT₂受体主要表达于损伤区的神经元，而不表达于星形胶质细胞。表明CysLT₁和CysLT₂受体可能与NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤有关。2．CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特，能减轻NMDA诱导的神经元损伤，并抑制损伤后的CysLT₁受体表达上调，证实CysLT₁受体介导NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤。3．小鼠脑冷冻伤后CysLT₁受体表达上调，表达高峰是6～24h；主要表达于损伤周边区的神经元。CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特对小鼠脑冷冻伤具有时间依赖的神经保护作用，其治疗时间窗为损伤后30min。说明CysLT₁受体介导小鼠脑冷冻伤后急性期神经元损伤，CysLT₁受体拮抗剂普鲁司特对脑外伤可能有治疗作用。