第一章慢性胰腺炎后新发糖尿病的荟萃分析目的:3c型糖尿病（T3cDM）是一种与胰腺外分泌疾病相关的其他特殊类型糖尿病,慢性胰腺炎（CP）是其最常见的病因。本研究进行系统的文献综述,以评价CP相关糖尿病的流行程度、时间进程及分析相关协变量,为临床预防CP患者继发糖尿病提供依据。方法:通过系统地检索Pubmed、Embase及Cochrane三大数据库,以CP后发生新诊断糖尿病或接受胰岛素治疗的糖尿病为标准,搜索截止到2019年7月发表的前瞻性及回顾性研究的英文文献。使用NOS量表对纳入文献进行质量评价,采用Stata 12.0软件进行meta分析。采用95%可信区间计算所有结局指标。结果:本研究纳入15篇文献,包括8970例CP患者。根据NOS评分系统显示,纳入文献得分在4-6之间。CP后新发糖尿病发生率为30%（95%CI,27%-33%）;其中,17%（95%CI,13%-22%）为依赖胰岛素的新发糖尿病患者。3项随访时间小于36个月的研究中,新诊断糖尿病发生率为15%（95%CI,10%-20%）;3项随访时间为36至60个月的研究中,糖尿病发生率为31%（95%CI,27%-35%）;另有9项随访时间超过60个月的研究,糖尿病发生率为33%（95%CI,29%-37%）。CP后新诊断的糖尿病患病率从36个月内的15%上升到60个月内的33%。年龄（p=0.856）、性别（p=0.445）、BMI（p=0.596）、吸烟（p=0.586）、酒精性胰腺炎（p=0.443）、和钙化（p=0.842）对研究结果的影响较小。结论:CP后糖尿病的发生率与病程相关。对已确诊的CP患者,必须定期监测其血糖水平,预防糖尿病,降低胰腺癌发病风险。需要进一步的研究解决本荟萃分析的局限性并寻找更进一步的证据阐明CP发生糖尿病的危险因素。第二章慢性胰腺炎小鼠胰腺内分泌功能的变化目的:通过比较雨蛙素联合脂多糖腹腔内注射和胰管结扎两种造模方式诱导的慢性胰腺炎（CP）小鼠模型,观察小鼠胰腺内外分泌细胞形态及功能的变化,为探究胰腺炎后内分泌功能损伤机制提供实验依据。方法:取120只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象。雨蛙素造模组（n=10）采用反复腹腔内注射雨蛙素（50μg/kg）联合脂多糖（10mg/kg）的方法构建,其对照组（n=10）注射等量生理盐水。胰管结扎组（n=50）及其对照组（n=50）在术后第3天、1周、4周、12周和24周分别进行IPGTT和IPITT,并处死取胰尾组织进行组织学处理。造模期间每周测小鼠体重和空腹血糖。采用HE染色及Mason染色评估造模是否成功;采用免疫组化染色检测I型胶原（Col-I）和纤维连接蛋白（FN）的表达;采用实时定量PCR检测胰腺纤维化相关m RNA的表达;利用免疫荧光染色评估CP小鼠胰腺内外分泌部胰腺星状细胞（PSCs）的活化及胰岛α和β细胞变化情况;TUNEL荧光观察胰岛细胞凋亡。结果:与对照组相比,雨蛙素联合脂多糖造模后小鼠体重及胰腺质量均明显下降,但空腹血糖没有明显变化,胰腺组织切片染色结果显示模型组小鼠胰腺存在明显的炎症和纤维结缔组织,小鼠的胰岛内存在α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的PSCs细胞,在胰岛内以及胰岛周围均可见Col-I和FN沉积。对胰岛进行分类计数和分析,结果显示模型组小鼠胰岛所占面积较对照组小鼠相比明显减少,但雨蛙素联合脂多糖造模组胰岛α细胞与β细胞的分布较对照组相比并无明显的改变。胰管结扎术后1周,两组小鼠体重均降至最低值,第3周升高至术前体重水平,此后逐渐升高。胰管结扎后胰尾质量逐渐减轻,一直持续到术后4周,术后12周胰尾的质量基本恢复至术前。两组小鼠术前术后血糖无明显变化,且两组之间均未见统计学差异。组织学染色结果显示,胰管结扎造模3d后,胰尾部出现腺泡细胞空泡样改变,组织间隙水肿明显,大量炎细胞浸润;造模1周后腺泡出现坏死;造模4周后开始出现腺泡萎缩,部分腺泡被导管样结构所代替,导管周围及腺泡间出现不同程度的纤维化;造模12周后部分胰腺组织被脂肪组织替代。胰管结扎小鼠胰尾部早期出现胰岛增生,12周后胰岛面积显著减少,大胰岛数量减少,但胰岛细胞的分布与假手术组相比并没有明显的改变。通过检测胰管结扎鼠胰尾α-SMA的miRNA表达水平,发现胰管结扎1周后α-SMA表达大量增加,持续至24周,且与ColⅠ的mRNA增加水平相平行。胰管结扎小鼠的胰岛内存在较多活化的PSCs细胞,并且晚期胰岛β细胞凋亡增加。结论:本课题通过比较雨蛙素联合脂多糖腹腔注射及胰管结扎建立的CP模型,发现胰管结扎建立的胰腺炎模型更严重,且更适合观察胰岛细胞的变化。胰管结扎小鼠早期出现胰岛增生,晚期胰岛面积显著减少,且大胰岛数量减少,胰岛β细胞凋亡增加。模型组小鼠胰岛内外分泌组织均见活化的PSCs增多,可能是CP导致胰腺内分泌破坏的原因之一。这为进一步研究PSCs活化对胰岛β细胞生物学特性的影响及其相关机制提供了依据。第三章TGF-β1刺激的PSCs外泌体miR-140-3p和miR-143-3p通过靶向调控BCL2促进胰岛β细胞凋亡目的:近年来外泌体miRNA在糖尿病发病机制中发挥的作用越来越受人们关注。本研究首先探讨TGF-β1处理的胰腺星状细胞（PSCs）来源外泌体对胰岛β细胞存活率和功能的影响,继而从外泌体miRNA角度出发探索PSCs对胰岛β细胞的作用机制。方法:收集小鼠胰腺星状细胞系（mPSCs）培养基上清,采用超速离心分离并纯化外泌体,使用透射电镜、纳米微粒跟踪分析技术和Western blot鉴定外泌体;外泌体经荧光标记后与小鼠β细胞系MIN6细胞共孵育48 h,检测MIN6细胞的摄取外泌体水平。以PBS或TGF-β1（2ng/mL）处理mPSCs,分别收集上清提取外泌体（C-Exo和T-Exo）。将MIN6细胞分为对照组、C-Exo组和T-Exo组,对照组培养基中加入PBS,后2组加入相应外泌体。CCK8和葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验（GSIS）分别检测各组细胞的活力和胰岛素分泌功能;Tunel和流式细胞技术检测各组细胞凋亡率;Western blot检测凋亡信号通路相关蛋白caspase-3的表达。进行高通量测序比较C-Exo组与T-Exo组外泌体miRNA表达差异,并进行鉴定。转染miR-140-3p和miR-143-3p minics及NC到胰岛β细胞和小鼠原代胰岛,q RT-PCR检测miR-140-3p和miR-143-3p的表达,并检测细胞活力,胰岛素分泌功能及caspase-3蛋白的表达。采用miRDB、Target Scan和miRTarget 3个软件进行差异miRNA的靶基因预测,转染mimics及inhibitors后检测B细胞淋巴瘤-2（BCL2）mRNA和蛋白的表达以验证其与miR-140-3p和miR-143-3p的靶向关系。结果:在透射电镜下,外泌体为不均匀分布的、类圆形的、直径30～100nm的囊泡;粒径检测显示其直径集中在30～150nm;Western blot显示外泌体标志蛋白质CD63、CD81和TSG101表达阳性。PKH26标记的外泌体与胰岛β细胞共孵育结果显示,β细胞能够大量摄取mPSCs分泌的外泌体。两种外泌体干预后,MIN6细胞胰岛素释放功能未见明显改变,但T-Exo干预后胰岛素含量有明显下降。T-Exo组的MIN6细胞存活率和增殖率显著低于CExo组,凋亡率增加（p<0.05）;且相较于对照组,T-Exo组MIN6细胞内cleaved caspase-3蛋白表达显著上调（p<0.05）。通过外泌体二代测序筛选,发现TGF-β1处理mPSCs可影响外泌体miRNA表达谱,其中36个miRNA显著差异表达,其中miR-140-3p和miR-143-3p在T-Exo中高表达。qRT-PCR验证,与C-Exo组相比,T-Exo处理后MIN6细胞和胰岛均高表达miR-140-3p和miR-143-3p。且TGF-β1处理mPSCs后细胞内miR-140-3p和miR-143-3p显著升高。与Nc对照相比,miR-140-3p和miR-143-3p minics转染后,MIN6细胞及胰岛内miR-140-3p和miR-143-3p表达水平升高（p<0.05）,且MIN6细胞活力下降和细胞凋亡率增加,cleaved caspase 3蛋白表达显著上调（p<0.05）。利用生物信息学方法分析miR-140-3p和miR-143-3p下游靶基因是BCL2。与Nc对照相比,miR-140-3p和miR-143-3p minics转染后MIN6细胞内BCL2的m RNA和蛋白表达均显著下调（p<0.05）。结论:本研究成功提取mPSCs分泌的外泌体,且该外泌体能够被胰岛β细胞摄取。TGF-β1活化的mPSCs可通过外泌体miR-140-3p和miR-143-3p降低β细胞存活率及其胰岛素的合成,其机制可能通过抑制BCL2的m RNA和蛋白表达,最终激活β细胞凋亡信号通路。