论文部分内容阅读
一、目的吴茱萸碱／吴茱萸次碱(EVO/RUT)是吴茱萸提取物的主要活性成分,药理学研究发现二者通过激动辣椒素受体,耗竭神经元／纤维的神经递质而阻断疼痛传导,并可下调环氧合酶-2的表达或抑制其活性,可能是一种多通道的镇痛药物。但辣椒素受体激活伴随CGRP的合成和释放增加可能带来全身不良反应,局部用药是更好的选择。本课题在研究提取物纯度与溶解度、表观分配系数、体外经皮渗透能力的关系以及化学促渗剂对其透皮的促进作用的基础上,构建不同载药量的吴茱萸提取物乳膏；考察乳膏对热板和福尔马林致小鼠疼痛的抑制作用,并通过对神经递质CGRP及炎性因子PGE2的表达量测定,结合炎性细胞的浸润程度观察,探讨提取物外用制剂在体镇痛的可能机制。本课题首次探索吴茱萸提取物局部施予的形式、EVO/RUT经皮渗透规律及其影响因素,目的是为吴茱萸提取物新适应症及给药途径的研究开发提供基础。二、方法与结果1.提取物纯度对溶解度及表观分配系数的影响采用平衡法和摇瓶法测定不同纯度提取物中EVO和RUT的溶解度及表观分配系数,考察纯度对溶解度和表观分配系数的影响。结果EVO和RUT总纯度为71.0%、49.2%和25.4%的提取物中EVO和RUT在PEG-400中溶解度分别为：8～14mg/mL和13～19mg/mL;在异丙醇中均小于7mg/mL。介质对EVO和RUT的溶解能力依次为PEG-400>Tween-80>RH-40>MCT>无水乙醇≈1,2-丙二醇≈1,3-丁二醇≈异丙醇；1gP在0.6～1.2之间。纯度影响EVO和RUT在水性和油性溶剂中的溶解度(p<0.01或p<0.05),纯度越高,溶解度越低,而对其在表面活性剂中的溶解度无明显影响(p>0.05)；纯度与表观分配系数无相关性(p>0.05)；pH值对提取物中EVO和RUT的溶解和分配均无明显影响。2.提取物纯度及促渗剂对体外经皮渗透的影响建立体外经皮渗透实验方法,探讨了纯度和促渗剂对EVO和RUT体外经皮渗透行为的影响；采用胶带剥离角质层,考察角质层在经皮渗透中的作用,研究EVO和RUT体外经皮渗透的特点和规律,并利用DSC法探索促渗剂对EVO和RUT促渗的可能机制。不同纯度提取物中EVO和RUT的渗透速率分别为0.15～0.18μg/h·cm2和0.17～0.21μg/h·cm2,时滞分别在5.46～6.63 h和7.68～8.83h之间,单位面积24 h累积渗透量均在1.88～3.35μg/cm2之间,表现出渗透速率慢,时滞长,渗透量低的特点,渗透动力学符合零级方程。各纯度间累计渗透量和渗透参数无显著差异(p>0.05)。去除角质层后,EVO和RUT经活性表皮的渗透速率及累积渗透量提高了3-6倍(p<0.01或p<0.05),但时滞无差异(p>0.05),表明角质层是EVO和RUT经皮渗透的主要屏障,在活性表皮的扩散过程是其限速步骤。油酸能提高EVO和RUT的渗透速率Js至0.40-0.51(p<0.05)；而Transcutol则能使EVO的扩散系数Dm提高至1.74左右(p<0.05),时滞缩短至3.88 h(p<0.05)。将脂溶性较高的促渗剂油酸或橙花叔醇及O/W型表面活性剂Transcutol配伍使用,能提高EVO和RUT的渗透速率,并缩短时滞。DSC结果显示促渗剂通过增加角质层脂质的流动性发挥促渗作用。3.提取物外用制剂的构建及评价单因素考察筛选了乳膏类型、HLB值、乳化剂组合等因素对乳膏外观、粒子形态、粘稠性和累积渗透量的影响,确定以O/W型乳膏为好,处方组成为：高纯度吴茱萸提取物(0.1%～0.4%)、PEG-400(25%)、单硬脂酸甘油酯(1%)、十八醇(8%)、橙花叔醇(5%)、Span60(4.1%)、RH-40(3.9%)、丙二醇(5%)。乳膏外观为淡黄色半固体,均匀细腻,pH为6.81±0.04,锥入度在102.4～119.7 mm。通过改良制备工艺,将药物PEG-400溶液加入油相,避免了水对EVO和RUT溶解度的不良影响,提高了乳膏的载药量。分散相的PEG-400未向连续相转移,未出现明显的析晶或相分离现象；乳膏于西林瓶中40。C和-20℃条件下放置10天,外观无明显改变。0.1%、0.2%和0.4%乳膏中EVO和RUT经离体乳猪皮肤的累积渗透量呈载药量依赖性(p>0.05)。4.提取物乳膏的局部镇痛作用及机制研究采用昆明小鼠为模型动物,考察提取物乳膏对热刺激和化学刺激引起疼痛的作用,并采用ELISA测定疼痛部位皮肤中CGRP及PGE2的表达,利用组织切片考察疼痛部位炎性细胞浸润的程度,探讨乳膏在体镇痛的可能机制。局部应用提取物乳膏能提高小鼠对热刺激和化学刺激的耐受(p<0.01或p<0.05),并呈载药量依赖性。ELISA结果表明提取物乳膏能明显降低皮下注射福尔马林3min后疼痛部位皮肤中CGRP的表达(p<0.05),且CGRP随时间的变化减小(p<0.05)；而乳膏对皮肤中PGE2的含量无影响(p>0.05)；组织切片结果证实提取物乳膏能显著抑制福尔马林引起的炎症细胞浸润程度(p<0.05),推测镇痛机制可能是耗竭并阻断CGRP的传导并协同抗炎作用,但抗炎作用的具体机制仍需进一步研究证实。三、结论提取物纯度能影响EVO和RUT的溶解度,而对表观分配系数及体外经皮渗透的影响无显著差异。EVO和RUT经皮渗透的主要屏障是角质层,在活性表皮的扩散是其限速步骤,具有渗透速率慢,时滞长,渗透量少的特点,渗透动力学符合零级方程,上述特点能为剂型与处方设计提供指导,通过提高制剂载药量,添加促渗剂可改善药物的经皮渗透。促渗剂可通过增加角质层脂质的流动性改善EVO和RUT的经皮渗透行为。提取物乳膏具有良好的镇痛作用,其镇痛机制表现出多重性,可能与耗竭并阻断CGRP的传导并协同抗炎作用有关。