心力衰竭（heart failure）简称心衰（HF）,是指由于心脏的收缩功能和/或舒张功能发生障碍,静脉回心血量不能充分泵出心脏,导致心室充盈压力增高,静脉系统血液淤积,动脉系统相对充盈不足,组织灌注不足,从而引起心脏循环功能障碍的综合征。心衰并不是一个独立的疾病,而是心脏疾病发展的终末阶段。尽管我们使用多种药物和非药物的方式治疗心衰,心衰患者的5年生存率仍然仅有50%。随着人口老龄化,心衰患者也日益增加,心衰的治疗已经成为世界关注的重要公共卫生问题之一。心力衰竭的临床特征是水钠潴留,在晚期失代偿心衰患者中表现的尤为突出。心脏及肾脏之间有多重共同作用的通路,相互影响,互为因果。心力衰竭的主要病理生理机制是血管收缩/钠潴留系统（肾素-血管紧张素-醛固酮系统、交感神经系统、精氨酸加压素系统）和/或血管舒张/钠排泄（钠尿肽系统）系统调节失衡导致液体潴留和电解质平衡紊乱。尽管利尿剂,β受体阻滞剂,血管紧张转换酶抑制剂（ACEI）,血管紧张素受体阻断剂（ARB）和利钠肽类药物的应用可以显著改善心衰患者的症状,延长生存时间,但是对于晚期失代偿心衰伴利尿剂抵抗和/或稀释性低钠血症的患者,仍需要探索更加安全、便捷和有效的治疗措施来解决机体水钠潴留的状态,提高患者的生存率。本课题组在以往的临床实践中发现,在心衰伴水钠潴留的患者给予糖皮质激素补充治疗,可以改善肾功能,增加肾小球滤过率,产生强大的促利尿作用,提高生存率。但是其药理学机制并不明确。我们通过临床和动物实验均证实了糖皮质激素可以抑制RAAS系统,降低血管紧张Ⅱ和醛固酮的浓度,产生强大的利尿作用。同时,我们还通过动物实验证实了糖皮质激素可以上调肾脏钠尿肽A型受体（natriuretic peptide receptor A,NPR-A）的表达,激活钠尿肽系统,从而增加肾脏血流量,改善肾功能,产生强大的利尿作用。早期研究发现,心衰患者由于神经内分泌系统激活,激素精氨酸加压素（arginine vasopressin,AVP）水平非渗透性升高而出现异常的水钠潴留、低渗透压和稀释性低钠血症。心衰时持续性AVP非渗透性释放通过肾脏精氨酸加压素2型受体（V2R）的激活调控下游的水通道蛋白和钠通道蛋白,导致水钠潴留和低钠血症,这是导致死亡和住院的危险因素。血浆AVP水平与慢性心衰患者的心衰严重程度和/或生存率密切相关。由于低钠血症的临床不良后果,V2R拮抗剂被开发用于治疗心衰患者的低钠血症。同时,人们观察到皮质醇功能减退的患者会出现低钠血症,在给予糖皮质激素补充治疗后症状得到纠正。这些前期研究都使我们猜测糖皮质激素是否也可能通过抑制V2R起到增加水钠排泄的作用呢?为了研究糖皮质激素对精氨酸加压素系统的影响,我们通过左冠状动脉结扎术造成大鼠心梗后心力衰竭模型,饲养8周后给予急性水负荷形成慢性心衰伴稀释性低钠血症模型,评估糖皮质激素对心衰大鼠稀释性低钠血症和左心室功能的改善作用,并进一步探讨糖皮质激素促水钠排泄作用的分子学机制。肌酐清除率（Creatinine clearance,Scr）作为评估肾小球滤过率（glomerular filtration rate,GFR）的标志性指标之一,容易受到饮食、生理或病理因素的影响。所以不能作为衡量GFR的金标准。胱抑素C在人体大多数细胞组织中稳定的表达,以恒定的速率产生,完全被肾小球滤过并在近端小管被重吸收和降解。由于其一般不容易受到饮食、性别、年龄、药物等外界因素的影响,因此对于GFR的评估优于Scr及其他内源性标志物。然而,以往的研究报道,皮质类固醇激素等非肾因素可以增加血清胱抑素C水平,但不影响肾功能,其机制尚不清楚。因此,我们给予正常大鼠糖皮质激素,采用金标准法（菊粉清除率法）测定GFR以及循环和组织中的胱抑素C水平,探讨糖皮质激素对胱抑素C的影响及其机制。第一部分糖皮质激素改善心衰大鼠水钠排泄和左心功能目的:心衰患者大多同时伴有肾功能不全,而肾功能不全又导致心衰症状进一步加重,二者之间形成一个恶性循环,从而加重患者心肾损伤,导致病情恶化。我们以往的临床研究表明,糖皮质激素可以改善慢性失代偿心衰患者临床症状和肾功能,产生强大的利尿作用。本研究采用动物模型,旨在明确糖皮质激素对慢性心衰伴稀释性低钠血症大鼠心肾功能的改善作用。方法:1.利用左冠状动脉前降支结扎法造成大鼠心肌梗死模型,8周后形成慢性心衰。腹腔注射6%体重的去离子水,形成慢性心衰伴稀释性低钠血症大鼠模型。2.把实验动物随机分成4组:假手术组（CON组）,慢性心衰组（CHF组）,糖皮质激素治疗组（DEX组）,糖皮质激素及糖皮质激素受体（GR）抑制剂联合治疗组（RU486+DEX组）。3.通过测定尿量、尿钠、尿渗透压、血钠和血渗透压等指标评估糖皮质激素对心衰大鼠水钠潴留的改善作用。4.评估糖皮质激素对心衰大鼠肾功能的影响。5.评估糖皮质激素是否对大鼠心脏纤维化有改善作用。6.采用Millar压力-容积导管评估心衰大鼠左心功能。结果:1.生理指标在急性水负荷试验中,与假手术组相比,心衰大鼠肾脏水钠排泄能力显著受损。CHF组大鼠在慢性心衰和急性水负荷的共同作用下表现为:尿量减少,血钠浓度升高,血渗透压降低,尿钠排泄量减少,尿渗透压升高。值得注意的是,在给予地塞米松预处理后6小时内,大鼠就明显表现出尿量的增加（P<0.01）。在药物预处理第6小时我们给予6%体重水负荷,随后地塞米松预处理的心衰大鼠依然可以排出额外的自由水摄入（P<0.01）。由于地塞米松引起排水增加,使心衰大鼠的血钠,血氯恢复至正常水平,成功逆转了心衰大鼠的稀释性低钠血症。此外,DEX预处理可逆转心衰大鼠急性水负荷诱导的血浆渗透压下降。DEX导致尿量增多的同时,伴随着尿钠的增多。DEX预处理的有益作用均可被糖皮质激素受体（GR）拮抗剂RU486所抵消,说明这些作用是GR介导的。2.糖皮质激素对肾功能的影响我们研究了糖皮质激素对心衰大鼠肾功能的影响,与正常对照组相比,心衰大鼠的肌酐清除率显著降低（P<0.01）,血清肌酐升高（P<0.05）,地塞米松可以增加肌酐清除率,降低血清肌酐（P<0.01）。但是四组间尿蛋白/肌酐并没有统计学差异（P>0.05）。这种有益的作用可被糖皮质激素受体（GR）拮抗剂RU486阻断,提示这些作用是GR介导的。3.糖皮质激素对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响我们通过Western blot和马松染色法研究地塞米松对心脏胶原蛋白的影响。我们发现,地塞米松抑制胶原蛋白Ⅰ的表达,但并不影响胶原蛋白的表达Ⅲ。马松染色同样证实地塞米松对心脏有抑制胶原蛋白合成增加的作用。4.血流动力学指标我们通过Millar压力-容积导管研究了DEX对心衰大鼠左心功能的影响。主要研究了收缩末期压力-容积关系（end-systolic pressure-volume relationship,ESPVR）、左心室压力上升最大速率（maximal slope of systolic pressure increment occurs early during isovolumic contraction,+d P/dtmax）、前负荷补充功（preload recruitable stroke work,PRSW）、等容松弛常数（iso-volumic relaxation constant,Tau）、左心室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）五个常见指标。收缩期末压力-容积关系（ESPVR）描述了心室在不同的左室充盈容积下所能产生的最大压力。ESPVR被认为是最可靠的心室收缩力指标。在实验中,我们通过阻断大鼠下腔静脉改变前负荷,绘制出不同负荷下心室收缩终点的压力和相应的容积值,从而得到一条具有一定斜率的直线。心力衰竭时,ESPVR变平并向右移位,表示心肌收缩力下降。由于ESPVR不受前负荷、后负荷和心率变化的影响,因此与其他血流动力学参数如射血分数、心输出量、+d P/dtmax和卒中体积相比,它是一个更好的收缩功能指标。每搏功即心肌收缩力,不仅随后负荷变化,也随前负荷变化。因此,通常采用每搏功与舒张末期容积的线性关系作为衡量心脏收缩力的指标,称为前负荷补充功（PRSW）,其对前后负荷的变化非常不敏感。心力衰竭时,心肌收缩力减弱,PRSW的斜率变小。收缩压增量的最大斜率（+d P/dtmax）出现在等容收缩的早期,是与心脏收缩力相关的参数之一。然而,+d P/dtmax受前负荷、后负荷、心率和心肌肥厚的影响,收缩力指数较差。松弛常数（Τau）表示心室压力在等容舒张期的指数衰减。多项研究表明Tau对心脏前后负荷不敏感。心力衰竭时,左室舒张压和右房压升高,Τau延长。左室舒张末期压（LVEDP）,即心脏的前负荷,是心脏收缩前心肌纤维的负荷,即舒张末期流向心室的血流量。LVEDP是心力衰竭最重要的标志。心衰时LVEDP升高,当心衰加重或失代偿时,同样可导致LVEDP升高。LVEDP的增加意味着体积超载或液体潴留。前负荷越大,下一次心脏收缩的压力越大。数据显示,与正常对照组相比,CHF组大鼠的ESPVR（环中的红线所示）降低（P<0.01）,地塞米松增加了CHF大鼠的ESPVR（图2A和B）（P<0.01）,心衰大鼠的Tau较正常对照组明显增加（P<0.05）,地塞米松预处理可以降低心衰大鼠的松弛常数（P<0.05）（图2 E）,心衰大鼠的LVEDP较正常大鼠明显升高（P<0.05）,地塞米松可降低心衰大鼠的LVEDP（P<0.01）（图2 F）。四组间+d P/dt_max和PRSW无差异（图2C和D）（P>0.05）。这些参数的变化说明心衰大鼠的心肌收缩力降低,地塞米松在增加尿量的同时显著改善了心脏的收缩功能和舒张功能。地塞米松预处理的有益作用均可被GR拮抗剂RU486所抵消,提示这些作用是由糖皮质激素受体介导的。第二部分糖皮质激素对心衰时精氨酸加压素通路的作用及分子生物学机制目的:失代偿心衰伴低钠血症时,心排血量减低、相对有效循环血容量不足不但激活了交感神经系统、RAAS系统,也导致AVP释放明显增加,AVP V2受体（V2R）表达增加,从而激活下游的腺苷酸环化酶,促进集合管水通道蛋白（AQP）的表达增加,机体排水能力下降,最终导致水潴留和稀释性低钠血症。我们的研究目的是通过动物实验,观察糖皮质激素是否可以通过抑制V2R-AQP途径,增加肾脏对自由水的排泄能力。方法:用定量Western Blot技术检测肾脏内髓V2受体的表达,免疫组织化学技术确定V2受体的表达部位。用定量Western Blot技术检测肾脏内髓水通道蛋白2（AQP2）和水通道蛋白3（AQP3）的表达,免疫组织化学技术确定水通道蛋白的表达部位。结果:1.糖皮质激素对心衰大鼠血浆AVP的作用既往的研究发现CHF伴低钠血症的患者血浆AVP浓度升高。为了进一步研究糖皮质激素对血浆AVP水平的影响,我们通过ELISA实验检测了各组大鼠血浆AVP水平。我们并没有发现CHF组大鼠与假手术组大鼠血浆AVP水平存在明显的统计学差异（P>0.05）,这可能与心衰大鼠水负荷后血浆渗透压明显下降,暂时下调了AVP水平有关。地塞米松治疗明显下调了心衰大鼠血浆的AVP水平（P<0.05）。2.糖皮质激素下调心衰大鼠V2R的表达肾脏对水的重新收主要是通过表达在集合管基底膜外侧的V2R调控。在对心衰大鼠的研究中发现血清AVP浓度升高导致了下游AQP2的上调是导致心衰水潴留的主要原因。为了研究糖皮质激素对心衰大鼠肾脏V2R的影响,我们通过Western blot检测了V2R在肾脏内髓中的表达。结果表明,CHF大鼠V2R表达高于正常对照组（P<0.05）。然而,DEX治疗降低了CHF大鼠集合管的V2R表达（P<0.05）。DEX对V2R的抑制作用可以被GR拮抗剂RU486阻断（P<0.05）（图2A）。提示这种抑制作用是通过糖皮质激素受体介导的。免疫组化结果显示V2R定位于集合管基底膜侧,进一步验证了WB的结果。3.糖皮质激素下调心衰大鼠肾脏内髓质组织AQP2的表达V2R的激活可以调控AQP2向顶端膜穿梭,从而导致肾脏对自由水的渗透性增加。为了确定糖皮质激素对AQP2的影响,我们用western blot和免疫组化方法检测了AQP2蛋白的表达量和表达部位。AQP2表达在肾脏内髓集合管顶端膜,免疫印迹在25KD处有一条蛋白带,在35-45KD处有一条糖基化蛋白带。我们发现与假手术组相比,心衰大鼠的肾脏内髓集合管中的AQP2显著增加（P<0.05）,而DEX预处理可以明显降低了AQP2的表达（P<0.05）。糖基化的AQP2表达了同样的趋势。我们通过免疫组化明确了AQP2的组织学定位,证实了WB的结果。4.糖皮质激素下调心衰大鼠肾脏内髓质组织AQP3的表达V2R的激活可以调控AQP3向基底外侧膜穿梭,把主细胞的水重吸收入血液。和AQP2的实验方法相同,为了确定糖皮质激素对AQP3的影响,我们用western blot和免疫组化方法检测了它们的表达。AQP3表达在肾脏内髓集合管基底膜,免疫印迹在32KD处有一条蛋白带,在40-55KD处有一条糖基化蛋白带。我们发现AQP3在心衰大鼠内髓集合管的表达也较假手术组大鼠显著升高（P<0.05）,DEX明显下调AQP3的表达（P<0.01）糖基化的AQP3表达了同样的趋势。我们通过免疫组化明确了AQP3的组织学定位,确认WB的结果。第三部分糖皮质激素通过精氨酸加压素通路逆转心衰大鼠体内钠排泄目的:心衰时,V2R也可以激活钠通道,使肾脏内髓钠通道表达增加导致体内钠潴留。这部分实验我们通过对血清和糖皮质激素诱导激酶1（SGK1）、上皮钠通道（ENa C）、钠钾二氯共转运体（NKCC2）和钠钾ATP酶（NKA）的研究,确定糖皮质激素对心衰大鼠盐代谢的调节作用。方法:用定量Western Blot技术检测肾脏内髓SGK1的表达。用定量Western Blot技术检测肾脏内髓集合管ENa C、NKCC2和NKA的表达,免疫组织化学技术确定钠通道相关蛋白的表达部位。结果:1.糖皮质激素下调心衰大鼠肾脏内髓组织α-ENa C的表达心衰伴稀释性低钠血症的大鼠肾脏ENa C表达丰度增加（P<0.05）。给予地塞米松预处理可以下调心衰大鼠肾脏ENa C的表达量（P<0.05）。而GR抑制剂RU486可以逆转地塞米松的这一作用（P<0.05）,提示地塞米松对ENa C的抑制作用是由糖皮质激素受体介导的。2.糖皮质激素下调心衰大鼠肾脏内髓组织NKCC2的表达在心衰伴稀释性低钠血症的大鼠其肾脏内髓组织NKCC2的表达明显高于假手术组（P<0.05）。地塞米松预处理显著降低了心衰大鼠NKCC2的表达丰度（P<0.05）。但是,给予RU486的大鼠,并没有逆转地塞米松的这种作用（P>0.05）。这说明地塞米松对NKCC2的抑制作用可能没有通过经典的GS途径。3.糖皮质激素对心衰大鼠肾脏内髓组织NKA的表达没有影响与假手术组相比,结果显示CHF组NKA的表达与假手术组并没有统计学差异（P>0.05）。同样,地塞米松预处理对心衰大鼠NKA表达无影响（P>0.05）。4.糖皮质激素下调心衰大鼠肾脏内髓组织SGK1的表达我们发现心衰大鼠肾脏SGK1的表达量明显高于假手术组（P<0.05）。地塞米松预处理可以下调心衰大鼠肾脏SGK1的表达（P<0.05）。但是我们并没有发现GS抑制剂RU486可以逆转心衰动物SGK1的表达（P>0.05）。第四部分糖皮质激素通过促进大鼠体内胱抑素C的产生增加循环中胱抑素C的水平目的:胱抑素C是一种新的内源性GFR标记物。有报道称糖尿病、甲状腺疾病、急性肾损伤、癌症、心脏功能障碍以及甾体类药物对循环中胱抑素C的水平有显著影响。因此,我们设计了本研究,以确定糖皮质激素对循环和肾脏功能中胱抑素C水平的影响。方法:1.将SD大鼠随机分为3组,正常对照组（CON）、地塞米松组（DEX）、糖皮质激素抑制剂组（DEX+RU486）。2.菊粉清除率的测定。3.用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆和肾、脑、肠、肝、肺五种组织胱抑素C。结果:1.地塞米松对血浆胱抑素C水平和菊粉清除率的影响治疗2天后,给予地塞米松的大鼠血浆中胱抑素C水平明显高于对照组大鼠。GR拮抗剂RU486完全逆转了地塞米松对胱抑素C水平的影响。但三组间肾菊粉清除率无统计学差异。2.DEX对组织中胱抑素C的影响为了研究DEX对胱抑素C的影响,我们采集了肾、脑、肠、肝、肺五种器官组织匀浆。糖皮质激素治疗组大鼠的胱抑素C水平明显高于对照组。与血浆胱抑素C水平的结果一致,RU486也能抵消DEX对上述组织中胱抑素C的影响结论:1.心衰大鼠肾脏水钠排泄能力降低、心脏功能严重受损,导致水钠潴留和稀释性低钠血症。给予地塞米松治疗可以显著增加心衰大鼠的水钠排泄能力,恢复正常的血浆渗透压,纠正稀释性低钠血症。地塞米松还可以增加心衰大鼠左心室的收缩力,恢复正常的左室舒张末期压力,改善心衰大鼠的左心功能。地塞米松的排钠利尿和改善心功能作用可以被糖皮质激素受体抑制剂RU486所消除,提示这些效应是糖皮质激素受体介导的。2.心衰大鼠的血浆AVP水平和肾脏V2R表达均较正常大鼠显著升高。地塞米松预处理可以降低血浆AVP,下调肾脏V2R蛋白表达丰度。地塞米松对血浆AVP和肾脏V2R的下调作用可以被RU486消除。说明糖皮质激素可以抑制精氨酸加压素系统。3.心衰大鼠肾脏内髓集合管AQP2和AQP3的表达增加造成体内水排泄受损,地塞米松可以下调肾脏AQP2和AQP3的表达,增加肾脏对水的排泄。心衰时,肾脏ENa C和NKCC2的表达增加,造成钠排泄障碍。地塞米松可以下调肾脏ENa C和NKCC2的表达,增加钠的排泄。以上说明糖皮质激素通过抑制精氨酸加压素途径调控下游水钠通道的蛋白表达,增加了心衰伴稀释性低钠血症大鼠的水钠排泄。4.糖皮质激素在不影响肾功能的情况下,可以促进组织中胱抑素C的产生,导致血清胱抑素C水平升高。