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前言大肠癌是我国常见的几种恶性肿瘤之一,目前对大肠癌发生的分子生物学机制的探讨主要集中在抑癌基因方面,其中结直肠癌缺失基因fDeleted inColorectal Carcinoma,DCC)的发现及其功能与调控作用在大肠癌中的重要性越来越受到重视,约＞50%的大肠癌中都发现了DCC表达缺失。目前对DCC失表达机制研究较多的是等位基因杂和性缺失和点突变,但是作为表遗传学基因表达调控的一种重要方式——DNA异常甲基化是否也参与了大肠癌中DCC失表达的发生,目前国内外还尚未见报道。本研究通过免疫组化和甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)方法检测了71例大肠癌患者手术切除肿瘤组织DCC蛋白表达和DCC基因启动子甲基化情况,并就DCC失表达与其基因启动子甲基化及临床病理参数的相关性进行了分析。材料与方法1、大肠癌标本:收集中国医科大学附属一院2005.4-2007.3经病理诊断明确的大肠癌手术切除标本及相应的癌旁组织71例。癌旁组织取于距肿物5cm以上无癌细胞浸润的肠粘膜:其中正常肠组织39例;炎性组织22例;不典型增生组织10例。所有患者术前均末接受放、化疗及其他抗癌治疗。每例标本分两部分保存,一部分经石蜡包埋用于免疫组化染色,一部分放入-80℃冰冻保存用于MSP。2、免疫组化:取石蜡包埋的大肠癌组织和癌旁组织,4μm厚连续切片,常规脱蜡,柠檬酸缓冲液(pH6.0)微抗原修复,DCC单克隆抗体(1:100稀释,博士德公司)4℃过夜,生物素标记的二抗(1:200稀释)37℃30min,S-P复合物37℃30min,DAB显色,复染、脱水、透明、封固。结果判定:高倍镜下计数5个视野的阳性细胞数和总数细胞数,求出阳性细胞的百分比,阳性细胞数＜10%为阴性,反之为阳性。3、MSP.酚-氯仿法提取基因组DNA进行NaHSO3修饰:利用NaOH使1μgDNA变性,并进行亚硫酸氢钠修饰。Wizard DNA纯化系统(Promega)对修饰后的DNA标本进行纯化,再次碱变性后乙醇沉淀,溶解后用于PCR扩增模板。SssI甲基化酶试剂盒(NEB)处理的人外周血淋巴细胞DNA做为阳性对照,ddH2O做为阴性对照。PCR产物加于2.5%琼脂糖凝胶中电泳,0.1%EB染色,凝胶成像系统照相分析。结果判定:只要甲基化引物扩增出目的条带,则可判定DCC基因启动子发生甲基化。4、统计学分析:采用SPSS13.0统计软件包处理数据,P＜0.05为有统计学意义。结果1、大肠癌及癌旁组织中DCC蛋白表达情况癌组织中DCC蛋白表达水平(35/71,49.3%)显著低于癌旁正常组织(34/39,87.2%,P＜0.001)。2、大肠癌及癌旁组织中DCC基因启动子甲基化状态癌组织中DCC基因启动子甲基化发生率(54/71,76.1%)高于癌旁正常组织(14/39,35.9%,P＜0.001)和癌旁炎性组织(10/22,45.5%,P=0.007)。3、大肠癌及癌旁组织中DCC蛋白失表达与基因启动子甲基化的相关性癌组织中DCC蛋白失表达组DCC启动子甲基化发生率(34/36,94.4%)显著高于DCC蛋白表达组(20/35,57.1%,P＜0.001)。4、大肠癌中DCC蛋白失表达及启动子甲基化与临床病理参数的相关性DCC蛋白表达与Dukes分期相关(x~2=9.976,P=0.023);DCC基因启动子甲基化水平与肿瘤发生的部位有关,直肠癌患者甲基化发生率(28/31,90.3%)高于结肠癌患者(27/40,67.5%,P=0.022)。讨论在癌旁正常组织、炎性组织、不典型增生组织到癌组织的癌变进展过程中DCC蛋白表达水平逐渐降低,其中癌组织DCC表达水平显著低于癌旁正常组织,可见DCC蛋白在大肠癌中确实存在失表达,且这种失表达可能促进了大肠癌的发生。另外DCC失表达与临床Dukes分期相关,Dukes分期越差,DCC蛋白失表达就越明显,推测DCC失表达可能促进了大肠癌的浸润及远处转移。进一步对DCC启动子甲基化的研究发现,在癌旁正常肠组织、炎性组织、不典型增生组织及癌组织中甲基化率呈升高趋势,且癌组织中DCC甲基化水平显著高于癌旁正常组织和炎性组织,提示DCC基因启动子甲基化很可能参与了大肠癌的发生发展过程。另外DCC启动子甲基化与大肠癌发生的部位有关,直肠癌DCC甲基化发生率高于结肠癌。将癌组织及癌旁组织DCC启动子甲基化情况与DCC蛋白表达水平联系起来观察得出:大肠癌组织中DCC蛋白失表达组甲基化发生率显著高于DCC蛋白表达组,提示DCC启动子甲基化与DCC蛋白失表达有一定的关系,启动子甲基化可能是参与大肠癌中DCC失表达的一个主要机制。结论1、大肠癌组织中确实存在DCC蛋白失表达,且与大肠癌患者Dukes分期有关;2、大肠癌组织中存在高频率DCC基因启动子甲基化的发生,且与直肠癌的关系更为密切;3、DCC基因启动子甲基化可能是大肠癌中DCC失表达的主要机制之一。