鸡抗菌肽属β-防御素类,为鸡先天性免疫的重要组成部分,具有广谱抗微生物和免疫增强作用,并且与宿主的先天性和适应性免疫系统有着联系,因而成为当前生物医学的研究热点之一。本研究选鸡β-防御素-2（Gallinacin-2,简称Gal-2）作为研究对象,运用分子生物学技术,从青脚麻鸡肺脏组织中克隆出Gal-2 cDNA片段,并构建pMD18-T-Gal-2克隆载体和pPIC9k-Gal-2表达载体,甲醇诱导表达后得到含有Gal-2目的蛋白上清液,对上清产物的生物活性进行了初步研究。具体内容和结果如下:1.登陆GenBank,参考已注册的鸡β-防御素cDNA序列（NM₂04992）,设计两对引物P₁/P₂、P₃/P₄,其中P₃/P₄含有EcoR I和Not I两种酶切位点,P₁/P₂扩增Gal-2 cDNA全序列片段,P₃/P₄扩增编码成熟肽cDNA片段。抽提的总RNA利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得cDNA第一链,以P₁/P₂为引物PCR扩增Gal-2 cDNA全序列片段,对PCR产物进行纯化回收,构建pMD18-T-Gal-2克隆载体。提取纯化克隆质粒测序,经GenBank的BLAST比对:克隆的青脚麻鸡Gal-2 cDNA全序列共有195个碱基对,与GenBank公布的序列（NM₂04992）相比,同源性达100%;分析Gal-2 cDNA编码框推导其肽链分别由20个氨基酸残基的信号肽、8个氨基酸的原片段、36个氨基酸的成熟肽组成。以pMD18-T-Gal-2质粒为模板,P₃/P₄为引物PCR扩增出108个碱基对的成熟肽编码片段。2.将青脚麻鸡Gal-2成熟肽cDNA片段和pPIC9k空载体双酶切后连接,构建pPIC9k-Gal-2表达载体。PCR鉴定的阳性转化子增菌后提取质粒测序,经GenBank的BLAST比对,构建的表达载体中的成熟肽片段与GenBank公布的序列（NM₂04992）相比同源性为100%,没有发生突变。将表达载体pPIC9k-Gal-2线性化后电转化入酵母表达菌株GS115体内,经组氨酸缺陷培养基筛选后,获得阳性转化子,经甲醇诱导表达,分泌的上清液冷冻干燥浓缩后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。结果表明,Gal-2蛋白分子量约为3.9ku,可存在于酵母分泌的上清和酵母菌体中,最佳诱导时间为48h,灰度扫描显示蛋白表达量占总分泌蛋白量的63.7%。微量琼脂平板扩散法检测表达产物体外生物活性,结果显示表达的Gal-2蛋白对大肠埃希氏菌（CMCC44102）、乙型副伤寒沙门氏菌（CMCC50094）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）和金黄色葡萄球菌（ATCC26113）有一定的抑菌活性。综上所述,本研究成功从青脚麻鸡肺脏中克隆出Gal-2目的片段,构建了克隆载体pMD18-T-Gal-2和表达载体pPIC9k-Gal-2,并将表达载体导入到酵母体内,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳检测得到含有Gal-2蛋白的酵母分泌上清液,蛋白分子量与预测一致为3.9ku。诱导表达的上清液对大肠埃希氏菌（CMCC44102）、乙型副伤寒沙门氏菌（CMCC50094）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）和金黄色葡萄球菌（ATCC26113）有一定的抑菌活性。