研究背景和目的动脉粥样硬化是一种以动脉壁内胆固醇等脂质代谢紊乱为主要特征的慢性炎症性疾病。近年来,其发病率呈明显上升趋势,已成为危害国民健康导致人口死亡的社会公共卫生问题。动脉粥样硬化形成过程复杂,发病机制涉及内皮细胞的损伤、脂质的浸润、血小板的黏附、单核/淋巴等炎症细胞的趋化、血管平滑肌细胞的增殖迁移等。尽管动脉粥样硬化形成过程非常复杂,但目前大家普遍认可慢性炎症反应和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的重要病理生理学基础,炎症反应和脂质代谢紊乱贯穿动脉粥样硬化发生和发展的全部过程,且二者又相互影响。在炎症、氧化应激等因素的诱导下,循环血液中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)在内皮下被氧化修饰而形成氧化低密度脂蛋白(oxidize low density lipoprotein, Ox-LDL)。一方面,Ox-LDL能被巨噬细胞吞噬,并激活巨噬细胞分泌细胞因子及化学趋化因子,加强炎症细胞浸润。另一方面,炎症反应能诱导内皮细胞激活、单核细胞募集和巨噬细胞的氧化应激,导致巨噬细胞大量吞噬Ox-LDL形成泡沫细胞,最终加速胆固醇蓄积和泡沫细胞形成,而泡沫细胞的形成又可导致多种炎症因子释放。鉴于泡沫细胞的形成是早期动脉粥样硬化形成的标志,因此,研究脂质代谢与炎症反应的相互关系及相关机制对泡沫细胞形成和动脉粥样硬化防治具有重要意义。胰岛素样生长因子家族(insulin-like growth factors, IGFs)是一类旁分泌和(或)自分泌的生长因子,其在细胞生长、增殖、代谢和维持葡萄糖稳态具有重要作用。IGF家族成员包括IGF配体IGF1和IGF2,两类特异性受体IGF-1R和IGF-2R,以及六种不同类型的结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP).迄今为止,已有大量临床研究表明,IGF配体,特别是IGF1在动脉粥样硬化的形成过程中发挥着重要的调节作用。研究发现IGF1可促进平滑肌细胞增殖、迁移和纤维帽的形成,促进动脉粥样硬化的发展。同时,IGF1又可作为心血管疾病的保护因子,与抗炎和抗氧化应激作用有关。然而,目前国内外研究IGFs对动脉粥样硬化的关系主要集中在IGF1上,IGF2与动脉粥样硬化的关系尚不清楚。IGF2在巨噬细胞中发挥的作用尚不清楚。在巨噬细胞中,IGF2直接作用的信号通路能否调控动脉粥样硬化的炎症反应尚未知,有待进一步探讨。白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)可由机体的许多种细胞产生,如单核巨噬细胞、造血干细胞、血管内皮细胞等。它作为机体重要的促炎症细胞因子,能够引发下游一系列的促炎级联信号反应的放大,如促进C反应蛋白(C-reaction protein, CRP)、纤维素原、白蛋白等肝脏急性反应蛋白的合成。同时,大量研究表明,IL-6是动脉粥样硬化及其他心血管疾病重要的预测因子,其表达水平与心血管疾病的预后及心血管事件的发生紧密相关。虽然研究已证实Ox-LDL能够影响巨噬细胞中IL-6的表达和炎症反应,但是,Ox-LDL调控巨噬细胞中炎症反应的具体机制仍不清楚;Ox-LDL调控巨噬细胞中IL-6的分子机制仍未被完全阐明。核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)作为重要的转录因子,它能与多种靶基因启动子或增强子κB序列特异性结合,从而调控多种细胞因子和黏附因子的转录和表达,其激活被认为是动脉粥样硬化发生发展的核心机制之一。同时,大量研究已证实,在不同类型的细胞中,Ox-LDL能够激活或抑制NF-κB信号通路从而影响促炎症因子的表达。研究表明,NF-κB被激活后,其易位入核的二聚体与特异DNA序列结合后,可上调包括IL-6在内的促炎症因子的转录。然而,由于细胞类型、处理方式、剂量和时间的差异,Ox-LDL对THP-1巨噬细胞NF-κB的作用仍不清楚。在巨噬细胞中,Ox-LDL能否通NF-κB信号通路上调细胞中的IL-6的表达仍有待进一步探讨。综上所述,IGF2与动脉粥样硬化的关系尚不清楚;在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL如何调控NF-κB和IL-6表达的分子机制仍未被完全阐明；Ox-LDL能否通过NF-κB信号通路调控细胞中的IL-6的表达有待进一步研究；前期研究提示IGF2参与调控巨噬细胞中的炎症反应,然而IGF2影响动脉粥样硬化的炎症反应的具体机制有待进一步探究；IGF2是否能够影响炎症相关基因NF-κB和IL-6的表达尚未见相关文献报道；Ox-LDL能否介导IGF2和NF-κB来调控细胞中IL-6的表达尚不清楚。因此Ox-LDL、IGF2、 NF-κB和IL-6之间相互作用的关系仍有待进一步探讨。本研究发现在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL可浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞中IGF2、NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表达水平。过表达IGF2后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应更加显著。采用siRNA敲减IGF2后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应被逆转。采用siRNA敲减NF-κB后,Ox-LDL上调IL-6蛋白表达的效应被逆转。因此我们得出结论：Ox-LDL可能通过IGF2-NF-κB途径诱导THP-1巨噬细胞中IL-6的表达。材料与方法1、细胞培养THP-1细胞生长于含10%的新生小牛血清的RPMI-1640培养基,37℃、5%C02细胞培养箱中静置培养。培养过程中加入1% 100 U/ml的青霉素和100μg/mL的链霉素。取对数生长期细胞进行实验,在每次实验前用100 nM佛波酯孵育THP-1细胞24h,诱导分化形成巨噬细胞,更换培养基后加不同浓度梯度的Ox-LDL孵育48h使其转化成泡沫细胞。2、Ox-LDL的准备将LDL (200 mg protein/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液加入含硫酸铜(5 mM free Cu2+)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行氧化,37℃孵育24小时。加入含200mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS溶液终止其氧化反应。然后在37℃下透析48小时以去除Cu2+,最后通过0.45mm的过滤器进行过滤灭菌。LDL的氧化性是通过硫代巴比妥反应物(TBARS)与丙二醛双(二甲基醇缩醛)(MDA)作为标准。该Ox-LDL中TBARS的含量与LDL中TBARS的含量比是6.03:0.31nmol/100mg(P<0.01)。新制备的Ox-LDL保存在50 mMTris-HCl,0.15 M NaCl and 2.0 mM EDTA中,其保存的pH为7.4,并在使用前十天之内准备。3、RNA提取和实时荧光定量PCR用TRIzol试剂盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)提取THP-1巨噬细胞的总RNA,将1μg总RNA用反转录成20μl cDNA。实时荧光定量PCR在ABI7500FAST仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上进行,溶解曲线分析表明PCR反应是否特异。以GAPDH的表达量为内参,并以AACt法对mRNA的表达进行量。本实验采用以下的引物序列IGF2正向,5’-GGAAC CC AC ATTGGCCTGA-3’;IGF2反向,5’-CCGGCGA GGCAGAATATAA CAC-3’;NF-κB正向,5’-GCCTCCACAAGGCAG CAAATA-3’ NF-κB反向,5’-CACCACTGGTCAG AGACTCGGTAA-3’ IL-6 正向,5’-AAGCCAGAGCTGT GCAGATGAGTA-3’; IL-6反向,5’-TGTCCTGCAGCCACT GGTTC-3’;4、免疫印迹分析采用南京凯基生物科技有限公司的蛋白提取试剂盒提取THP-1巨噬细胞中的蛋白,随后用其公司的BCA量化蛋白测定试剂盒对蛋白的浓度进行测定。对蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS,混匀并煮沸10分钟,冷却后置冰箱待用。采用12%-15%琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白,按说明书要求依次电泳、转膜、封闭后以兔多克隆抗IL-6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)和兔多克隆抗IGF2、NF-κB (Abcam, Cambridge, MA, USA)一抗孵育过夜,以兔多克隆抗β-actin (Abcam)抗体为内参,洗涤孵育二抗再洗涤后,以化学发光法显示条带,检测目的蛋白的相对表达量。5、转染小分子RNATHP-1细胞株接种在6孔板(2×106/孔)中,采用Lipo2000转染人类IGF2、NF-κB特异性siRNA(IGF2-siRNA, NF-κB-siRNA)和对照siRNA。小分子RNA购买自锐博生物科技公司(Cambridgeshire, UK)。转染48小时后,Trizol收集并裂解细胞,提取总RNA用于mRNA检测,收集总蛋白用于免疫印迹的检测。6、重组质粒的构建从Invitrogen Corporation购买包含IGF2的PCR-XL-TOPO载体和PIRES2-EGFP载体。为了合成含有目的基因IGF2和EGFP的EcoRI-IGF2-IRES-EGFP-XhoI片段,我们随后将上述购买的两种载体采用重叠PCR进行连接反应。并将IGF2-IRES-EGFP片段和pcDNA3.1(+)载体连接。测序鉴定正确无误后,命名为pcDNA3.1-IGF2,用质粒试剂盒提取以备使用。通过脂质体2000将重组质粒转染到培养的细胞中,转染48小时后,Trizol收集并裂解细胞,提取总RNA用于mRNA检测,收集总蛋白用于免疫印迹分析过表达效果。7. ELISA法检测细胞上清IL-6采用ELISA商业试剂盒(上海研吉生物有限公司),检测收集好的细胞培养上清液中IL-6表达水平。所有操作均按照产品说明书步骤完成。将酶标仪检测波长调成450 nm,在10分钟内检测吸光值。在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本对应的IL-6浓度值。8、统计处理每组实验重复3次,采用SPSS 13.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行数据分析,计量数据以x±s表示(SDs)。各基因nRNA的相对表达量、各蛋白免疫印迹分析条带的相对灰度值比较采用t-检验和单因素方差分析。方差分析显著时进行多重比较,方差齐性采用Bonferroni法。统计结果以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、Ox-LDL可浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞中IGF2、NF-κB和IL-6的表达。研究表明,Ox-LDL能够明显促进细胞中NF-κB和IL-6的表达。在此部分,我们用0,25,50,100μg/mL的Ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞后,观察Ox-LDL对细胞中IGF2、NF-κB和IL-6的nRNA和蛋白表达水平的影响。结果显示Ox-LDL可浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞中的IGF2、NF-κB和IL-6 mRNA和蛋白表达水平。同时,与对照组相比,用50,100μg/mL的Ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞后,细胞培养上清液中IL-6表达水平有显著性差异。2、IGF2介导了Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中NF-κB和IL-6的表达。课题组前期研究已证实,IGF2能介导Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中的炎症反应。同时NF-κB和IL-6也是调控炎症反应的关键分子。因此,我们推测IGF2可能介导Ox-LDL上调NF-κB和IL-6的表达水平。为此,我们用IGF2过表达质粒转染THP-1巨噬细胞后,发现IGF2蛋白表达增加了887%；过表达IGF2后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应更加显著。采用小分子RNA干扰技术敲减THP-1巨噬细胞的IGF2后,IGF2蛋白表达减少了88%;IGF2 siRNA处理后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应被逆转。3. NF-κB介导了Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中IL-6的表达。研究表明,NF-κB作为体内重要的转录因子,其被激活后,可上调包括IL-6在内的多种炎症相关因子的转录和表达。然而,在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL能否通NF-κB信号通路上调细胞中的IL-6的表达仍不清楚。为此,我们采用小分子RNA干扰技术敲减THP-1巨噬细胞的NF-κB后,发现NF-κB蛋白表达减少了89%; NF-κB siRNA处理后,Ox-LDL上调IL-6表达的效应被逆转。结论1、在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL可浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞中IGF2、 NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表达水平。2、在THP-1巨噬细胞中,过表达IGF2后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应更加显著。采用siRNA干扰技术敲减IGF2后,Ox-LDL上调NF-κB和IL-6表达的效应被逆转。3、在THP-1巨噬细胞中,采用RNA干扰技术敲减NF-κB后,Ox-LDL上调IL-6蛋白表达的效应被逆转。