论文部分内容阅读
第一部分:Setd2在锶促进股骨缺损修复及成骨细胞分化中的作用研究目的:探讨锶对Setd2表达的影响以及Setd2在锶促进成骨细胞分化中的作用材料与方法:制备MBG和Sr-MBG,分别植入骨质疏松大鼠股骨缺损中,8周后取新形成的骨组织进行Masson染色、Runx2免疫组化染色比较两种材料促进成骨的效果。进行RNA-seq检测,并对RNA-seq结果进行分析,分析成骨相关基因表达、GO分析生物学作用、Pathway分析、以及组蛋白甲基化和去甲基化酶表达分析。对新形成的骨组织进行Setd2和H3K36me3免疫组化染色,验证二者在不同组的骨组织中的表达情况。在骨组织中对Runx2和Setd2、H3K36me3进行免疫荧光染色,分别将Runx2与Setd2、H3K36me3共定位。用含有不同浓度(0-3mM)SrCl2的成骨诱导培养基对人成骨细胞系MG63进行成骨诱导,检测ALP活性、成骨相关基因的表达和Setd2的表达以筛选刺激MG63的最适SrCl2浓度。用相应浓度SrCl2刺激MG63,不同时间后提取细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,Western blot检测验证MAPK通路活化情况和Setd2、H3K36me3表达情况。相应浓度的SCH772984、SP600125和SB203580对MG63进行预处理,抑制ERK、JNK和P38通路后,Western blot检测Setd2的表达情况。利用慢病毒载体系统对Setd2的表达进行干预,再用含有SrCl2的成骨诱导培养基对MG63进行成骨诱导,检测矿化结节形成能力和成骨相关基因表达水平。将Setd2的表达抑制后用SrCl2刺激MG63,Western blot检测p-ERK1/2的表达。实验结果:Masson染色结果发现Sr-MBG较MBG能够显著增加骨质疏松模型股骨缺损区新骨的形成,免疫组化显示Runx2阳性细胞所占比例在Sr-MBG组更大。RNA-seq成骨基因表达结果显示,在Sr-MBG组更多的成骨相关基因被上调。组蛋白甲基化和去甲基化酶表达分析结果显示在Sr-MBG组组蛋白甲基化酶Setd2上调最为显著。免疫组化结果也显示在Sr-MBG组Setd2和H3K36me3阳性细胞的比例更大。免疫荧光共定位发现Setd2和H3K36me3都表达于Runx2阳性的细胞中,H3K36me3仅在细胞核中有表达,而Setd2在细胞核与细胞质中均有表达。体外实验终浓度为1mM的SrCl2诱导MG63成骨向分化后,成骨相关基因和Setd2的表达量及ALP活性最高。SrCl2刺激MG63后细胞总蛋白、细胞核蛋白与细胞质蛋白中ERK1/2、P38、JNK在不同时间内活化,Setd2的表达和H3K36me3水平也在SrCl2刺激后升高。但是抑制了 ERK、JNK和P38通路后,SrCl2刺激无法升高Setd2的表达和H3K36me3水平。抑制Setd2的表达后,MG63在SrCl2刺激成骨诱导后矿化结节形成能力和成骨相关基因表达下降,而过表达Setd2后,MG63在SrCl2刺激成骨诱导后矿化结节形成能力和成骨相关基因表达升高。当抑制Setd2的表达后,SrCl2刺激无法升高MG63中p-ERK1/2的水平。结论:锶能够激活成骨细胞MAPK通路,提高Setd2的表达,进而促进成骨细胞分化。同时,Setd2能够升高p-ERK1/2水平,形成正向的反馈调节增加促进成骨的效果。第二部分:Setd2在锶促进牙周骨缺损修复及牙周膜干细胞成骨向分化中的作用研究目的:探讨锶对牙周骨缺损修复过程中Setd2表达的影响以及Setd2在锶促进牙周膜干细胞成骨向分化中的作用。材料与方法:制备MBG和Sr-MBG,分别植入骨质疏松大鼠牙周骨缺损中,4周后取牙周骨组织进行Masson染色、Runx2免疫组化染色比较两种材料促进成骨的效果,同时进行Setd2、H3K36me3和hnRNPL的免疫组化染色,检测Setd2、H3K36me3和hnRNPL在不同材料植入后在新形成骨组织中的表达。用含有不同浓度(0-3mM)SrCl2的成骨诱导培养基对人牙周膜干细胞进行成骨诱导,检测ALP活性、矿化结节形成能力、成骨相关基因的表达和牙周膜干细胞增殖情况以筛选刺激牙周膜干细胞的最适SrCl2浓度。用相应浓度SrCl2刺激牙周膜干细胞,不同时间后提取细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,Western blot检测AKT通路活化情况和Setd2、hnRNPL的表达情况。用相应浓度的MK2206对牙周膜干细胞进行预处理,抑制AKT通路后,用含或不含SrCl2的成骨诱导培养基诱导牙周膜干细胞进行成骨向分化,检测牙周膜干细胞矿化结节形成能力。并且用SrCl2刺激牙周膜干细胞后,Western blot检测抑制AKT通路后Setd2和hnRNPL的表达情况。利用慢病毒载体系统分别对Setd2和hnRNPL的表达进行干预,再用含有SrCl2的成骨诱导培养基对牙周膜干细胞进行成骨诱导,检测矿化结节形成能力、ALP活性、成骨相关基因表达水平。将Setd2的表达抑制后用SrCl2刺激牙周膜干细胞,检测hnRNPL的表达变化;同时,将hnRNPL的表达抑制后用SrCl2刺激,检测Setd2的表达变化。实验结果:Masson染色结果显示Sr-MBG较MBG能够显著增加骨质疏松模型牙周骨缺损区新骨的形成,免疫组化显示Runx2阳性细胞所占比例在Sr-MBG组更大。而且在Sr-MBG组Setd2和H3K36me3阳性细胞的比例更大,但是hnRNPL阳性细胞的比例较MBG组更小。体外实验终浓度为1mM的SrCl2诱导牙周膜干细胞成骨向分化后,ALP活性、矿化结节形成能力和成骨相关基因表达量最高,但是不同浓度的SrCl2对牙周膜干细胞的增殖没有影响。牙周膜干细胞总蛋白、细胞核蛋白与细胞质蛋白中AKT在SrCl2刺激5分钟后被激活,Setd2的表达和H3K36me3水平也在SrCl2刺激1小时后升高,而hnRNPL的表达则在SrCl2刺激2小时后受到抑制。用MK2206抑制了 AKT通路后,SrCl2刺激无法促进牙周膜干细胞成骨向分化,同时无法升高Setd2的表达,hnRNPL受抑制的情况也得到逆转。抑制Setd2的表达后,牙周膜干细胞在SrCl2刺激成骨诱导后矿化结节形成能力、ALP活性和成骨相关基因表达下降,而过表达Setd2后,牙周膜干细胞在SrCl2刺激成骨诱导后矿化结节形成能力、ALP活性和成骨相关基因表达升高。对Setd2表达的干预无论在有无SrCl2刺激下对hnRNPL的表达都没有影响。当抑制hnRNPL的表达后,牙周膜干细胞在SrCl2刺激成骨诱导后矿化结节形成能力、ALP活性和成骨相关基因表达升高。抑制hnRNPL的表达能够使Setd2表达升高,在SrCl2刺激后Setd2表达更高,而Setd2敲低和过表达之后对SrCl2刺激后hnRNPL的表达没有影响。结论:锶能够通过AKT通路抑制hnRNPL从而增加Setd2表达,促进牙周膜干细胞成骨向分化。