论文部分内容阅读
目的: 了解IFN-γ活化的THP-1源巨噬细胞分别对结核分枝杆菌3个菌株(mCherry-BCG、H37Rv、MDR)感染的控制效力,并探讨感染过程中结核分枝杆菌生存与巨噬细胞自噬之间的关系。 方法: 1.利用博奥晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)对3个菌株mCherry-BCG、 H37Rv、MDR进行菌种鉴定,并通过TCH、PNB鉴别培养基培养试验鉴定菌株分型;通过药敏培养基培养试验确定3个菌株的耐药谱。 2.PMA(佛波酯)诱导 THP-1分化,并从细胞贴壁、形态变化、细胞膜表面标志分子CD11b表达这三方面综合鉴定 THP-1是否已分化成巨噬细胞。PI/AnnexinV-FITC双染法FCM检测THP-1源巨噬细胞的凋亡情况。 3.IFN-γ致敏后再激活巨噬细胞,通过ELISA检测其分泌细胞因子TNF-α、IL-10的情况判断IFN-γ活化的M1型巨噬细胞模型建立与否。 4.浊度仪定量3个菌株,各自以 MOI(感染复数)10:1感染未活化(control组)、IFN-γ活化(IFN-γ组)、Rapamycin诱导自噬(Rapamycin组)、3MA抑制自噬(IFN-γ+3MA组)4组不同处理的巨噬细胞48h,稀释涂板法检测感染各组巨噬细胞的各个菌株的相对生存率。 5.Western Blot检测受感染的各组巨噬细胞自噬标志蛋白LC3B的表达水平。 6.采用SPSS17.0软件进行统计分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果: 1.经菌种鉴定,3个菌株属于结核分枝杆菌复合群。TCH、PNB鉴别培养基培养试验鉴定mCherry-BCG为牛型结核分枝杆菌,鉴定H37Rv、MDR为人型结核分枝杆菌;药敏培养基培养试验鉴定mCherry-BCG、H37Rv为敏感菌株,鉴定MDR为耐多药菌株(利福平、异烟肼耐药)。 2.经PMA10 ng/mL诱导48 h再静息3天,不贴壁的THP-1分化成贴壁的细胞,细胞形态变化明显,与人外周血人单核细胞衍生的巨噬细胞形态相似;同时较诱导前明显表达巨噬细胞膜表面分子CD11b;而且细胞凋亡率较小。 3.IFN-γ致敏后再激活的巨噬细胞大量分泌TNF-α,不分泌IL-10,说明巨噬细胞已被诱导向M1型活化。 4.mCherry-BCG生存率:Control组100％±0%,IFN-γ组48%±25%,Rapamycin组55%±12%,IFN-γ+3MA组81%±10%,经One-Way ANOVA后Dunnett法检验,与Control组比较,感染IFN-γ组巨噬细胞的mCherry-BCG生存率明显下降(P<0.01),Rapamycin组明显下降(P<0.05),IFN-γ+3MA组无明显差异(P>0.05)。 H37Rv生存率:Control组100%±0%,IFN-γ组104%±8%,Rapamycin组55%±3%,IFN-γ+3MA组111%±15%,经One-Way ANOVA后Dunnett法检验,与Control组比较,感染IFN-γ组巨噬细胞的H37Rv生存率无明显差异(P>0.05),Rapamycin组明显下降(P<0.01),IFN-γ+3MA组无明显差异(P>0.05)。 MDR生存率:Control组100%±0%,IFN-γ组109%±6%,Rapamycin组21%±3%,IFN-γ+3MA组100%±12%,经One-Way ANOVA后Dunnett法检验,与Control组比较,感染IFN-γ组巨噬细胞的MDR生存率无明显差异(P>0.05),Rapamycin组明显下降(P<0.01),IFN-γ+3MA组无明显差异(P>0.05)。 5.受mCherry-BCG感染的巨噬细胞:与Control组比较,IFN-γ组自噬水平明显增高,Rapamycin组自噬水平明显增高,IFN-γ+3MA组自噬水平无增高。 受H37Rv感染的巨噬细胞:与Control组比较,IFN-γ组自噬水平无明显增高,Rapamycin组自噬水平明显增高,IFN-γ+3MA组自噬水平无增高。 受MDR感染的巨噬细胞:与Control组比较,IFN-γ组自噬水平无明显增高,Rapamycin组自噬水平明显增高,IFN-γ+3MA组自噬水平无增高。 结论: 1.IFN-γ活化的THP-1源巨噬细胞控制各种结核分枝杆菌感染生存的效力高低与自身发生自噬水平的高低呈明显正相关,提示自噬在其杀菌机制中占据相当重要的位置。 2.某些结核分枝杆菌菌株比如本研究中的标准毒株H37Rv与耐多药菌株MDR可以策反IFN-γ活化的THP-1源巨噬细胞的自噬杀菌机制。