研究背景原发性肝癌是消化道常见肿瘤之一,全球第六位,每年新发约75万人次,在肿瘤所致的死因中排在第二位,治疗效果欠佳。近年来分子靶向药物的发展非常迅速。索拉非尼是一种多靶点抗肿瘤药,已被FDA批准用于晚期肝癌的治疗,是目前治疗肝癌相对有效的一种酪氨酸及被抑制剂。但是,患者对索拉菲尼的有效率仅有大约30%,并且通常在使6个月内发生耐药。因此,寻找提高索拉非尼治疗效果的方法是目前研究的热点。褪黑素是由松果体分泌的一种吲哚类生物活性物质,有昼夜节律的改变,生物学功能包括生理调节、抗氧化、抗炎、免疫调节、抑制肿瘤、增强传统化疗药物疗效等作用。而且,有临床研究表明褪黑素可以增强化疗效果并减少副作用,并提高肿瘤患者的生存时间和生活质量。已有索拉非尼对肺、前列腺、恶性黑色素瘤及乳腺癌的研究,国外文献也有索拉非尼联合化疗对肾、结肠肿瘤治疗的报道,这些都说明褪黑素可以作为潜在的联合使用的抗肿瘤药物。我们在前期研究中发现,褪黑素可增强阿霉素的抗肿瘤作用。但是褪黑素对靶向药物的增效作用报道较少,褪黑素联合索拉非尼对肝癌细胞的影响暂未见报道。自噬是回收不必要或功能障碍的细胞组分(比如蛋白质或者是细胞器)并加以降解可用以维持细胞代谢的稳定。但是自噬具有双刃剑的作用,过度的自噬可能使细胞产生自噬性死亡而不是保护作用。索拉菲尼可以调节自噬活性,可能对细胞起保护作用,这就可能解释了临床上索拉菲尼治疗效果欠佳。自噬抑制剂氯喹(CQ)可以增强药物的抗肿瘤作用或逆转耐药。因此索拉菲尼联合褪黑素对自噬的影响值得研究。目的本实验通过观察索拉菲尼、褪黑素单独用药、联合用药对人肝癌细胞增殖的影响,来证实二者联合用药在抗肿瘤治疗方面是否更具有优势。为进一步临床实验及治疗提供基础理论依据。方法(1)5个浓度的索拉菲尼作用于肝癌细胞24,48,72小时后,用CCK-8法检测抑制率,并计算索拉菲尼的IC50.(2)肝癌细胞与两种药物或分别与一种药物共培养48小时后,同样用CCK-8法检测细胞抑制率。并用药物相互作用指数(CDI)评价联合抗肿瘤作用。并用流式细胞术检测两种药物单独或联合作用于肝癌细胞株后的凋亡比率。并选取两药协同效应明显且能在人体达到的浓度进行后续实验。(3)采用筛选的两药物浓度,两种药物单独或联合作用于肝癌细胞后使用Western-Blot检测Bcl-2、Bax、LC3、P62蛋白的表达情况。(4)使用自噬抑制剂CQ(选取能明显升高自噬水平并且不影响细胞生长的合适浓度)加入索拉菲尼单药组以及联合用药组,观察加入CQ后细胞凋亡情况以自噬蛋白表达的情况。(5)加入自噬抑制剂CQ后用CCK-8法检测索拉菲尼或联合用药对肿瘤细胞的影响,并用流式细胞术检测凋亡。结果(1)结果显示索拉菲尼在HepG2和Bel-7402细胞株上表现为时间和剂量依赖的抗肿瘤效应。并且在两个细胞株上的IC50分别是13.21μmol/L和11.83μmol/L。(2)联合用药对HepG2和Bel-7402细胞的具有协同抑制作用,索拉菲尼(10μmol/L)与褪黑素(10-5mol/L)联合用药作用于HepG2和Bel7402细胞时,联合作用指数分别是0.827±0.09和0.91±0.05。(3)Annexin V/FITC-PI染色后,流式细胞术检测联合组的HepG2细胞的凋亡率明显升高,褪黑素单药组为6.79%±2.34%,索拉菲尼单药组为36.8%±1.51%,联合组为52.5%±12.56%,同样的结果在Bel-7402细胞株上也可观察到。(4)联合组与两种药单药组相比,Bcl-2蛋白水平明显下降而Bax蛋白的水平升高,并且联合组的Bcl-2/Bax比值与对照组以及索拉菲尼或褪黑素单药明显降低。(5)Western-Blot方法检测自噬蛋白LC3和P62表达情况,索拉菲尼单药组的自噬水平明显升高,但是在联合用药组,索拉菲尼引起升高的自噬水平被褪黑素降低,并伴有P62的相应变化。(5)加入自噬抑制剂氯喹(CQ)抑制后,索拉菲尼或联合组的自噬水平下降,并且细胞抑制率升高。用流式细胞术同样发现,加入氯喹后的索拉菲尼和联合组两组的细胞凋亡率也升高。结论(1)褪黑素联合索拉菲尼具有协同抗肿瘤作用。(2)褪黑素联合索拉菲尼是通过抑制自噬发挥协同抗肿瘤作用。(3)索拉菲尼单药组或联合组在加入自噬抑制剂CQ后细胞受到进一步抑制,并且细胞凋亡率比不加CQ前有明显升高。