研究背景与目的消化性溃疡(peptic ulcer,PU)是一种世界范围的常见的消化系统疾病之一。发病率在1.5%到3%之间,每年影响全球约400万人,约有10%的人一生中患过此病。PU可发生于食管、胃或十二指肠,其中以胃、十二指肠最常见。消化道出血、穿孔、幽门梗阻和癌变是PU常见的四大并发症。右旋雷贝拉唑钠(R-(+)-rabeprazole sodium,RRS)是雷贝拉唑钠(rabeprazole sodium,RS)旋光异构体的右旋体,是新一代质子泵抑制剂(proton pump inhibitor,PPI)。与其他已上市的PPIs单一旋光异构体相比,RRS具有个体差异小、起效更快、药效持久等优势。有研究报道,在水应激、非甾体抗炎药(例如吲哚美辛、阿司匹林)、幽门结扎等胃溃疡模型中,RRS作用强于左旋雷贝拉唑(S-(-)-rabeprazole sodium,SRS),是RS抗溃疡活性的主要异构体。然而,对PU大鼠模型尚未有系统的量化评价方法的文献报道。除此之外,RRS对大鼠糜烂性食管炎模型、十二指肠溃疡模型的药效学研究也未见文献报道。对于急性胃出血、休克、消化道手术、疾病应激性等重症患者,有必要开发RRS的无菌粉末型注射剂。在本论文中,我们运用糜烂性食管炎、胃溃疡、十二指肠溃疡模型,通过与SRS、RS对比,系统探究了 RRS的药效学作用。并且运用对比的方法,进行了图像量化评价方法的发现、建立、应用等方面的研究。通过与传统评价方法的对比,发现图像量化评价法用于PU模型药效学研究评价具有较强的优势、适用性和科学性。本论文首次建立了适用于PU模型评价及质子泵抑制剂类药物疗效评价的数字图像量化评价方法;首次运用图像量化评价法系统性研究了 RRS抗PU的药效作用,为抗PU类药物的系统性评价提供新的科学的研究方法和评价基础。实验方法分别复制大鼠糜烂性食管炎模型、幽门结扎型胃溃疡模型,乙酸型十二指肠溃疡模型,分别以 RRS 0.9、1.8、3.6mg·kg-1、SRS 1.8mg·kg-1 和 SS 3.6mg·kg-1的剂量实施治疗干预。经过定标、二值化、去背景、阈值设定、数据获取等图像处理过程,建立ImageJ图像量化评价法,获取溃疡面积、溃疡占比等关键指标。通过组间比较胃酸总分泌量、pH值、食管炎损伤面积、食管炎损伤占比、胃溃疡面积、胃溃疡占比、十二指肠溃疡面积等指标,评价RRS、SRS和RS的抗PU作用。通过类比的方法,探讨ImageJ图像量化评价法和传统分级计分法用于实验性溃疡研究的差异。1.胃液分泌功能实验70只大鼠随机分为7组后,药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组同法给予0.9%氯化钠注射液。给药完毕1h后,各组大鼠麻醉后,手术造模。术后将动物5 h后,收集胃液,测定胃蛋白酶活力,酸碱滴定法测定胃总酸含量,比色法测定酶解还原产物的吸光度,计算胃酸总分泌量、pH值及胃酸分泌抑制率、胃蛋白酶活力。2.糜烂性食管炎实验70只大鼠随机分为7组后,麻醉后,手术造模。各药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组给予等容量的0.9%氯化钠注射液。给药24 h后,分离并剪取食管,进行大体评分。采集组织黏膜数码图像,进行图像量化评价,获取食管损伤面积和食管损伤占比。3.幽门结扎型胃溃疡实验70只大鼠随机分为7组后,各药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组给予等容量的0.9%氯化钠注射液。麻醉后,手术造模。手术18 h后,摘取大鼠全胃,测量判定胃黏膜面溃疡程度,计算胃溃疡指数、胃溃疡抑制率。采集组织黏膜数码图像,进行图像量化评价,获取胃溃疡面积和胃溃疡占比。4.乙酸型十二指肠溃疡实验70只大鼠随机分为7组后,麻醉后手术,乙酸法复制十二指肠溃疡。各组大鼠经尾静脉注射相应的药物溶液,每天给药1次,连续7天。模型对照组和假手术组同法给予0.9%氯化钠注射液。末次给药后,麻醉处死,取出胃及十二指肠上部。分别采用直接测量法和图像量化评价法进行溃疡面积的测量。实验结果1.RRS对大鼠胃液分泌和胃蛋白酶活力的影响酸碱滴定法的结果表明,与模型对照组比较,RRS1.8、3.6 mg·kg-1组可显著抑制幽门结扎型模型的胃总酸分泌量,升高胃液pH值(P<0.05,P<0.01)。比色法测定结果表明,RRS 3.6 mg·kg-1和RS 3.6 mg·kg-1均能显著降低胃蛋白酶活力(P<0.05,P<0.01)。RRS 1.8 mg·kg-1 与 SRS 1.8 mg·kg-1 比较,无显著性差异(P>0.05)。RRS组的胃酸分泌抑制率和胃溃疡抑制率均高于等剂量的SRS组和RS组。2.RRS对大鼠食管炎的作用(a)分级评分法:EE模型大鼠单次尾静脉注射给药24 h后,与模型对照组比较,RRS 1.8、3.6 mg·kg-1和RS 3.6 mg·kg-1食管炎指数明显降低(P<0.05,P<0.01)。RRS 1.8 mg·kg-1 食管炎指数显著低于 SRS 1.8 mg·kg-1(P<0.05)。RRS 3.6mg·kg-1食管炎指数与RS 3.6 mg·kg-1无显著差异(P>0.05)。RRS 1.8、3.6 mg·kg-1食管炎抑制率分别高于 SRS 1.8 mg·kg-1、RS 3.6 mg·kg-1。(b)图像量化评价法:与模型对照组比较,RRS 0.9、1.8、3.6 mg·kg-1食管炎损伤面积、食管炎损伤占比显著降低(P<0.05,P<0.01)。RRS1.8 mg·kg-1食管炎损伤面积、食管炎损伤占比显著低于SRS 1.8 mg·kg-1(P<0.01)。RRS 3.6mg·kg-1与RS 3.6 mg·kg-1 比较,食管炎损伤面积、食管炎损伤占比无显著性差异(P>0.05)。3.RRS对大鼠胃溃疡的作用(a)分级评分法:幽门结扎型GU模型大鼠单次尾静脉注射给药5 h后,与模型对照组比较,RRS 1.8、3.6 mg·kg-1和RS 3.6 mg·kg-1溃疡指数显著降低(P<0.05,P<0.01)。RRS1.8、3.6 mg·kg-1 胃溃疡指数与 SRS 1.8 mg·kg-1、RS 3.6 mg·kg-1均无显著性差异(P>0.05)。RRS 1.8、3.6 mg·kg-1胃溃疡抑制率分别高于SRS 1.8 mg·kg-1、RS 3.6 mg-kg-1。(b)图像量化评价法:与模型对照组比较,RRS 0.9、1.8、3.6 mg·kg-1胃溃疡面积、溃疡占比显著降低(P<0.05,P<0.01)。RRS 1.8 mg·kg-1胃溃疡面积、溃疡占比显著低于 SRS 1.8 mg·kg-1(P<0.05,P<0.01)。RRS 3.6 mg·kg-1 与 RS 3.6 mg·kg-1胃溃疡面积、溃疡占比无显著差异(P>0.05)。(c)胃溃疡的病理结果:模型对照组大鼠胃黏膜损伤最为严重,10/10大鼠胃黏膜上皮变性坏死,且形成深层溃疡。SRS 1.8 mg·kg-1病变程度与模型对照组一致,10/10大鼠胃黏膜上皮变性坏死,且形成深层溃疡。RRS 0.9 mg·kg-1病变程度与模型对照组接近,1 0/10大鼠胃黏膜上皮变性坏死,且溃疡形成,7/10形成深层溃疡。RRS 1.8 mg·kg-1溃疡病变程度较模型对照组略有改善,10/10大鼠胃黏膜上皮变性坏死,且溃疡形成,4/10形成深层溃疡。RRS 3.6 mg·kg-1和RS 3.6 mg·kg-1黏膜上皮病变情况基本一致,8/10大鼠黏膜上皮变性坏死,7/10大鼠黏膜溃疡形成。4.RRS对大鼠十二指肠溃疡的作用(a)直接测量法:乙酸型十二指肠溃疡大鼠经尾静脉注射给药7 d后,与模型对照组比较,RRS 1.8、3.6mg·kg-1和RS 3.6mg-kg-1十二指肠溃疡面积显著降低(P<0.01)。与SRS 1.8 mg·kg-1比较,RRS 1.8mg·kg-1十二指肠溃疡面积显著降低(P<0.01)。RRS 3.6 mg·kg-1十二指肠溃疡面积与RS 3.6 mg·kg-1无显著差异(P>0.05)。RRS 1.8、3.6 mg·kg-1十二指肠溃疡抑制率分别高于SRS 1.8 mg·kg-1、RS 3.6 mg-kg-1。(b)图像量化评价法:与模型对照组比较,RRS 1.8、3.6 mg·kg-1十二指肠溃疡面积显著降低(P<0.01)。RRS的十二指肠溃疡抑制率优于等剂量的左旋体和消旋体。RRS 1.8、3.6 mg·kg-1十二指肠溃疡抑制率分别高于SRS 1.8 mg·kg-1、RS 3.6 mg-kg-1。5.不同评价方法的对比结果传统方法与图像量化评价法,二者所得数据结果总体接近,但略有不同。差异主要表现在:图像量化评价法提示糜烂性食管炎模型、幽门结扎型胃溃疡模型药效起效剂量略低于传统方法。ImageJ图像量化评价法能实现溃疡积分面积、溃疡所占比例的快速读取。图像量化评价法处理过程可控,具有较好的可重复性和可追溯性,能客观、准确地反映病变程度。结论本实验条件下,RRS 0.9、1.8、3.6 mg·kg-1具有抗糜烂性食管炎、抗胃溃疡作用。同时,RRS 1.8、3.6 mg·kg-1具有抗十二指肠溃疡作用。RRS 1.8mg·kg-1相较等剂量的SRS具有显著优势;RRS 3.6 mg·kg-1与RS 3.6mg·kg-1相当。ImageJ程序平台适用于酸反流性食管炎模型、幽门结扎型胃溃疡模型,乙酸型十二指肠溃疡模型图像数据的量化评价,损伤面积和损伤占比作为量化评价病变程度的指标更为科学。