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目的:分离正常人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC),CpG ODN作为刺激物,探讨其对DC生长、表面抗原(HLA-DR、CD86)表达、形态结构及其诱导DC体外对T细胞增殖及杀伤活性的影响;同时观察CpG ODN对肿瘤细胞上清培养DC的生长、膜抗原HLA-DR表达的调节作用,揭示CpG ODN对DC的免疫激活作用及增强DC抗肿瘤活性的机制,为CpG ODN可作为免疫佐剂应用于体内免疫调节提供理论依据。方法:⑴ 正常人外周血DC的分离与鉴定:按本室常规分离正常人外周血DC,细胞悬液涂片经S-100蛋白免疫细胞化学染色检测DC纯度。⑵ CpG ODN刺激DC条件的筛选:采用析因实验设计和方差分析,对DC培养体系中CpG ODN浓度、DC浓度以及培养时间三因素不同水平进行筛选。⑶ DC表面分子检测及电镜分析:流式细胞仪分析CpG ODN最佳条件刺激组、未刺激组DC表面抗原HLA-DR、CD86的表达,采用两样本U检验进行统计学分析;同时透射电镜观察两组DC的形态特征。⑷ 同种异体混合淋巴细胞反应(MLR):CpG ODN最佳条件刺激组和未刺激组DC与新鲜分离的同种异体T淋巴细胞共培养,MTT法检测并计算出各组别刺激指数(SI),利用Excel软件分析CpG ODN刺激后DC对T细胞的激发作用。⑸ 抗肿瘤实验:采用析因实验设计,探讨CpG ODN 对DC调节T细胞杀伤肿瘤活性的影响。⑹ 肿瘤细胞培养上清对DC的影响:收集胰腺癌细胞(ASPC-Ⅰ)培养上清,以不同浓度与DC共培养,MTT法检测不同培养时间的各孔光吸收值(A490);流式细胞仪分析肿瘤细胞上清培养和正常未用肿瘤细胞上清培养DC的表型。⑺ CpG ODN对肿瘤细胞上清培养DC的作用:实验分3组:①1μmol.l-1CpG ODN组;②含30%ASPC-Ⅰ培养上清液组;③1μmol.l-1CpG ODN+含30%ASPC-Ⅰ培养上清液组,各组分别与DC共培养72h,流式细胞仪分析各组DC表型,MTT 法检测各组光吸收值(A490)。结果:⑴ S-100免疫细胞化学染色示初分离DC纯度>90%。⑵ 析因实验结果示:不同浓度CpG ODN对DC生长产生明显效应(p<0.01),且与DC浓度具有交互作用(p<0.01)。CpG ODN刺激DC的最佳条件是1μmol.l-1CpG ODN、6×104孔-1的DC、培养36h。⑶ 透射电镜观察CpG ODN刺激DC的超微结构:CpG ODN最佳条件刺激组DC与未刺激DC相比其表面的突起细、长且规则,粗面内质网增多,空泡减少甚至消失。⑷ FCM分析显示CpG ODN对DC表面表型的影响:CpG ODN最佳条件刺激组DC细胞表面HLA-DR、CD86表达强度明显高于未刺激组(P<0.01)。⑸ CpG ODN对DC免疫刺激活性的影响:结果显示,CpG ODN最佳条件刺激组DC可明显刺激T细胞增殖,与未刺激组相比差异有显著性,且DC浓度越高,刺激能力越强。 <WP=5>⑹ 根据SAS统计软件数据处理结果得到CpG ODN诱导DC对T细胞杀伤活性影响的析因实验趋势:CpG ODN明显增强DC调节T细胞杀伤肿瘤的能力(P<0.05),最佳组合条件为:DC数目1×104孔-1、效靶比100:1、CpG ODN=1μmol.l-1。⑺ 肿瘤细胞培养上清对DC生长及表型的影响:MTT检测结果显示,含10%肿瘤细胞上清培养的DC其生长与正常组无明显差异;含30%肿瘤细胞上清培养的DC在第3天、含50%肿瘤细胞上清培养的DC在第1天和第3天生长被明显抑制(P<0.05),但第5天时,两者的抑制作用均不明显。FCM分析显示,肿瘤细胞上清培养DC表面HLA-DR表达强度明显低于正常培养组(P<0.01)。⑻ CpG ODN对肿瘤细胞上清培养DC的作用:结果显示,CpG ODN刺激组、含30%肿瘤细胞上清组及CpG ODN与含30%肿瘤细胞上清共培养组DC的存活率分别为1.350、1.020、0.849,三组之间差异显著(P<0.05或0.01);同时FCM分析显示上述三组DC表面HLA-DR表达的平均荧光强度为63.71、47.71、51.44,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:⑴ CpG ODN可诱导人外周血DC分化、成熟,增强DC调节T细胞杀伤肿瘤的活性。⑵ 肿瘤细胞培养上清抑制DC的生长和表面抗原的表达。⑶ CpG ODN可拮抗肿瘤细胞培养上清对DC生长的抑制及表面抗原表达的下调。⑷ 上述结果显示,CpG ODN对DC具有较强的免疫激活作用,对体外诱导DC及肿瘤环境DC作用效果均显著,表现出较强的免疫佐剂功能,为其应用于体内免疫调节提供了理论依据,其确切的分子机制尚需进一步的研究。