可注射性水凝胶是国际上近几年兴起的一种相对新颖的软骨组织工程材料，它提供了一类新的细胞固定机制，可注射性材料用于软骨缺损修复的优势在于材料与修复细胞之间嵌合连接好、塑形容易，细胞和生长因子能与材料充分均匀混合，且能通过关节镜或其它微创方式操作，安全、有效、费用低。本实验利用可注射性水凝胶——几丁质作为骨髓基质干细胞载体，在体外进行联合培养，为构建组织工程软骨组织提供实验依据。 材料与方法： 1实验动物成年SD大鼠10只，雄鼠体重120-140g，由中国医科大学实验动物中心提供。 2主要试剂和仪器几丁质(SIGMA公司)，DMEM(GIBCO公司产品)，新生牛血清(GIBCO公司产品)，percoll梯度分离液(PHARMACIA公司产品密度：1.073g/m)，胰岛素样生长因子IGF-I、转化生长因子TGF-β1(Sigma公司)、维生素C、地塞米松，CO2培养箱，倒置显微镜。 3几丁质凝胶的制备在10℃下，将几丁质(SIGMA公司)10g放入研钵中，加丙酮40ml研磨10min；边研磨边缓缓加入冷浓HCl400ml，充分研磨，使呈糊状.于4℃放置24h，之后用玻璃棉过滤，将滤液缓缓加入到盛有2000ml体积分数50％乙醇的烧杯中，边加边剧烈搅拌，然后静置，待胶态几丁质析出后去除清液，收集胶态几丁质；用蒸馏水冲洗胶态几丁质至pH7，以蒸馏水定容至1000ml，冷藏备用. 4BMSCs的分离，培养及鉴定实验动物，用4％的戊巴比妥钠麻醉后，在无菌条件下抽取股骨骨髓(抗凝处理)，用DMEM倍比稀释(1:1)，缓慢加入预先准备好的含percoll梯度分离液的试管中，1200r/min，离心20min，收取单个核细胞的界面层，DMEM洗涤，反复2次，加入含10％新生牛血清/DMEM的24孔板内，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养，48小时去除未黏附细胞，亦更换培养液，隔天换液，0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养。OLYMPUS倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。待原代骨髓干细胞增殖贴壁成单层后，收集细胞。取部分细胞进行碱性磷酸酶染色，茜素红染色和Mallory染色。 5传代培养、诱导、鉴定 取第四代细胞分为三组，实验组按1×105接种于24孔培养液，分别加入2mlDMEM无血清特定培养液(地塞米松0.4mg/L，TGF-β110ng/ml、IGF-I50ng/50ul，维生素C50ng/L)，并与2倍量几丁质凝胶混匀，培养诱导；对照组以同样浓度接种于24孔培养板，加入同样DMEM无血清特定培养液培养诱导；空白对照组同样浓度接种于24孔培养板单纯培养。内置玻片，置37℃、5％CO2培养箱中培养，每周2次换液。倒置显微镜观察，分别在诱导后7、14、21d取出载玻片，免疫组化检测BMSCS分化的软骨细胞分化的Ⅱ型胶原以及HE染色和阿尔新蓝染色。 6透射电镜观察收集原代BMSCs细胞和经培养诱导14dBMSCs细胞，于1.5ml离心管中，2％戊二醛固定24h，常规超薄切片透射电镜观察细胞超微形态。 7Ⅱ型胶原的含量分析联合培养7，14，21d随机取免疫组化染色切片，每组20张。在Linzux成像系统下对免疫组化结果进行检测，测量其辉度，计算百分比。 8统计学处理用SPSS11.5统计软件对数据进行统计学分析，差异性显著性采用t检验。 结果： 1电镜检查透射电镜下，细胞表面的褶皱状小突起是软骨细胞超微结构重多特征之一。可见实验组软骨细胞呈圆形或椭圆形，具有典型的褶皱状小突起，胞浆内粗面内质网数量很多，排列紧密，内质网池略多为扩张，充满颗粒物质，线粒体少，核内常染色体增多。对照组软骨细胞较小且少，成梭形。 2组织学检测HE染色：BMSCs传代第四代后，细胞外形呈现短柱状及三角状，胞核呈淡红色。联合培养后细胞形态变短，呈四方形，表现为“铺路石”样排列，阿尔新兰染色示细胞外基质分泌旺盛，呈碱性基质，染兰色。 3Ⅱ型胶原的免疫组化检测实验组在培养中7，14，21dBMSCs诱导分化的软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性，可见标黄色的颗粒分布于细胞浆内。基质染色较对照组更为明显。 4Ⅱ型胶原的含量分析见表1。讨论利用组织工程学方法构建透明软骨来修复关节软骨缺损是骨科领域正在积极探讨的课题。 组织工程的研究主要包括三个方面：种子细胞的离体培养、细胞外基质替代物、生物材料的研究及组织工程化的组织的构建。骨髓基质干细胞因其来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强，大量传代培养后仍具成软骨能力；同时，BMSCs具有多潜能性，根据环境而有不同的分化路途，在各自解剖位置，分别形成透明软骨、软骨下骨，而且BMSCs易于基因修饰调整，用于表达所需的细胞因子，所以BMSCs作为软骨组织工程的一种重要的种子细胞越来越被人们所重视。同时，获得优良的组织工程软骨与支架性质的优劣是分不开的。 可注射性水凝胶是一种相对新颖的软骨组织工程材料，其优势在于材料与修复组织之间嵌合连接好，塑形容易，细胞和(或)生长因子与材料充分均匀混合，且能通过关节或其它微创方式操作，治疗简单、安全、有效、费用低，不会遗留明显瘢痕，同时凝胶样材料适合于对细胞施加压力，凝胶的应变力对细胞产生应力刺激。 几丁质是一种天然生物高分子多聚糖，具有良好的生物相溶性和生物降解性，所有降解产物对人体均无毒性、无刺激、无免疫原性，无致突变效应，且该材料具有广谱抑制细菌、霉菌的作用。 本实验中BMSCs在几丁质凝胶中表现出良好的生存能力、黏附性、增殖能力和再分化，经软骨的诱导后，透射电镜下细胞具有典型的褶皱状小突起，细胞器发达，表现出软骨细胞良好的表型。HE染色，细胞成圆形或椭圆形，阿尔新兰染色细胞外基质分泌旺盛。Ⅱ型胶原免疫组化检测，实验组均为阳性，可见棕黄色颗粒分布于细胞浆，以软骨细胞周围明显，成条索状分布，与周围组织分界明显，基质染色较对照组更为明显。Ⅱ型胶原含量分析，实验组明显优于对照组(p＜0.05)。 实验证明，可注射性几丁质水凝胶能为BMSCs向软骨诱导分化提供所需的三维空间，有利于BMSCs向软骨细胞定向分化及细胞外基质合成。同时，其具有的取材广泛、安全性高、广谱的抑菌作用、低价格以及可注射性使其成为BMSCs组织工程软骨优良的天然的生物载体。 结论： 1骨髓基质干细胞具有诱导分化为软骨细胞的特性，可作为组织工程的种子细胞。 2可注射性几丁质水凝胶是一种理想的组织工程软骨的天然生物载体。