【摘 要】
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目的本研究通过高通量测序法对珠江水体浮游微生物多样性进行调查,通过微波消解-扫描电镜联用法（MD-VF-Auto SEM法）分别对动物实验及溺死案件样本与溺液硅藻一致性进行分析,探究水体浮游微生物在溺死地点推断中的作用,旨在为溺死地点推断研究提供依据。方法1.本研究在珠江广州段设置四个采水点,采集水样并提取水样的DNA,采用高通量测序平台Illumina Hiseq对样本的18S rDNA基因的V
【基金项目】
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广州市科技计划项目（2019030001,2019030012）；
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目的本研究通过高通量测序法对珠江水体浮游微生物多样性进行调查,通过微波消解-扫描电镜联用法（MD-VF-Auto SEM法）分别对动物实验及溺死案件样本与溺液硅藻一致性进行分析,探究水体浮游微生物在溺死地点推断中的作用,旨在为溺死地点推断研究提供依据。方法1.本研究在珠江广州段设置四个采水点,采集水样并提取水样的DNA,采用高通量测序平台Illumina Hiseq对样本的18S rDNA基因的V4可变区序列进行测序,通过生物信息学分方法进行序列分析和物种注释,了解珠江水体的群落组成情况;进一步通过alpha多样性和beta多样性分析可以进一步比较不同采水点之间的差异性。2.本研究设置动物实验及溺死检案,采用微波消解-扫描电镜联用法（MD-VF-Auto SEM法）对组织样本及水样进行检测,对数据进行统计及聚类分析,比较组织样本及水样中硅藻种类的一致性:（1）动物实验:20只实验兔分成两组,其中溺死组16只,于装有四个采水点水样的水箱中溺死放置24小时后解剖;空白组4只,立即处死后解剖;每只均取肺组织2g。采用微波消解-扫描电镜联用法（MD-VF-Auto SEM法）检测20例实验兔动物样本（肺、溺液）的硅藻数量及硅藻种类（记录到属）。（2）溺死案例:收集93例溺死案例样本（肝、肾、肺和水样）,采用微波消解-扫描电镜联用法（MD-VF-Auto SEM法）检测各样本的硅藻数量及硅藻种类（记录到属）。用SPSS 24.0对数据进行统计及聚类分析。结果1.基于18SrDNA的V4区对珠江四个采水点水样中的微生物多样性进行分析,共获得约583685条高质量序列,注释为1289个OTUs.对所得到的OTUs序列进行物种注释后发现,4个采样点的浮游生物物种多样性丰富,涵盖了6门187种,其中13号点的水样物种丰富度最低,8号点样本中的水体浮游生物与其他三个点差异较大。2.动物实验:肺组织和水样之间硅藻种类的一致性为0.25-0.75,当聚类距离为0-5、5-10和10-15时,分别有8/16、9/16和14/16个样本与水样可分别归为一个类。溺死案例:在93个案例中,闭合器官（肝、肾）和肺组织、器官（肝、肾、肺）和水样之间硅藻类型一致性为0.48-0.73。在30例溺死地点确定的案例中,一致性为0.57-0.67。当聚类距离为0-5、5-10和10-15时,分别有35/93、50/93和79/93个案例可分别归为一个类。结论在对珠江水体浮游生物多样性研究中,通过高通量测序技术识别了更多的物种,多样性分析发现了不同采水点之间物种组成的差别,根据差异物种,为建立浮游生物遗传标记,构建溺死地点推断方法提供了重要依据。在动物实验中,虽然溺死地点确定,水样即溺液,不一致性约为50%,一致性最高也仅为75%;实际案例中,在溺死地点确定的情况下,不一致率约为40%,而在溺水地点未确定的情况下一致率也为40%;肺组织和水样中硅藻的一致性并不是溺死诊断的必要条件。可见本研究中利用高通量测序技术对珠江水体浮游生物多样性调查,分析珠江广州段水体浮游微生物种群分布及种群序列,不仅为珠江广州段水体生物多样性提供基础资料,且有利于找到更多溺死相关浮游微生物,为法医学溺死鉴定及溺死地点推断提供参考。
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