蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆分析及原核表达与纯化研究

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蜜蜂是重要的经济昆虫,也是昆虫大量试验的模式材料。丙糖磷酸异构酶(Triosephosphate isomerase TPI or TIM,EC5.3.1.1)是生物中广泛存在的一种糖酵解酶,存在于多种组织中,催化二羟丙酮磷酸与3-磷酸甘油醛之间的可逆反应,且在糖酵解、脂肪酸合成、糖原异生和戊糖磷酸途径中发挥着重要作用。为在分子水平上探明TPI的生物学功能,本文从意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的肌肉组织中提取总RNA,设计特异引物,采用RT-PCR的方法克隆了蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶(AMTPI)基因的cDNA序列。运用生物信息学的方法对蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因及其编码蛋白序列进行了初步分析,得到了基因和蛋白质组学研究中一些有价值的参数。AMTPI具有多种二级结构形式,是典型的(α/β)8结构,在SWISS-MODEL服务器三维建模后,运用ViewerLite5.0进行序列编辑,获得了AMTPI的三级结构模型。将测序结果(GenBank登录号EU76098)与GenBank中的其他物种进行同源性分析。多重比对显示AMTPI有多个保守结构,物种间的整体相似度较高,与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上,用MEGA4软件按MinimumEvolution方案进行分子系统演化分析,获得了TPI氨基酸序列的分子进化树,这为研究意大利蜜蜂的系统发生、遗传变异以及家系、亚家系的亲缘关系提供理论依据。将目的基因克隆到pGEX-4T-2原核表达载体上,并在大肠杆菌中得到了成功表达,4小时的表达量为总蛋白的42.1%。试验纯化了GST-AMTPI融合蛋白,并对产物进行了浓缩;为研AMTPI真核细胞中的表达,构建了真核表达载体,为进一步分析该酶的药理学活性提供参考。
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