肌苷生产菌的摇瓶发酵条件优化及代谢通量分析

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肌苷在食品和医药领域有着非常重要的用途:它是各种调味食品的营养助鲜剂,可以治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等疾病,同时也是抗生素生产的原料。但是,近年来随着国外厂家对中国市场的冲击,国内的核苷发酵产业面临着严峻的挑战,为此提高发酵得率、降低生产成本,提高生产能力已经成为当务之急。本论文以实验室前期选育的枯草芽孢杆菌JMUKC2为研究对象,以肌苷产量为主要指标,初步优化了枯草芽孢杆菌JMUKC2生产肌苷的摇瓶发酵工艺;研究了不同促进剂对枯草芽孢杆菌JMUKC2积累肌苷的影响;并用代谢通量分析的方法解释了不同促进剂的添加对肌苷生产菌JMUKC2摇瓶发酵积累肌苷的作用机理。从枯草芽孢杆菌JMUKC2产肌苷的摇瓶发酵培养基的基本成分及其发酵条件入手,利用单因素试验并结合正交试验对枯草芽孢杆菌JMUKC2的摇瓶发酵培养基及发酵条件进行了优化,并确定了其最佳摇瓶发酵培养基配方及最佳发酵条件。优化后的最佳摇瓶发酵培养基配方为:葡萄糖140g/L,酵母膏17g/L,玉米浆20g/L,尿素7g/L,硫酸铵20g/L,KH2PO47g/L,MgSO4·7H2O1g/L,CaCO320g/L。优化后的生物量和肌苷产量均比优化前有较大的提高:比初始培养基分别提高了41%和47%。优化后的最佳摇瓶发酵条件为:接种时间为18h,接种量为7%,装液量为15mL,发酵培养基的初始pH值为6.5,摇瓶发酵温度为37°C。枯草芽孢杆菌JMUKC2摇瓶发酵条件经过优化后,生物量和肌苷产量均比优化前有了较大的提高:比初始发酵条件分别提高了51%和222%。根据肌苷合成的不同调控机理,选择并研究了五种对菌体生长和肌苷积累均有促进作用的促进剂(柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、氟化钠、次黄嘌呤及氯化钙),且确定了其最适添加量,同时探讨了肌苷合成与菌体内蛋白质含量、核酸含量之间的关系。当复合添加这些不同组合的促进剂时,所得肌苷产量比添加单一促进剂时的肌苷产量会有显著的提高,其中当同时添加0.15%次黄嘌呤、2mg/L氟化钠、10mg/L氯化钙及15g/L葡萄糖酸钙时,肌苷产量达到了14.01g/L,是对照组肌苷产量的4.39倍。基于物料的质量守恒定律和代谢反应中间代谢物的拟稳态假设,结合发酵过程曲线,初步研究了不同促进剂的添加对肌苷发酵过程不同时段(24h-32h,56h-64h,80-88h)代谢流分布的影响。结果表明,添加不同的促进剂可以引发枯草芽孢杆菌细胞内的代谢流迁移,增大肌苷合成途径的代谢通量,而组合添加促进剂对肌苷合成代谢流的促进效果具有叠加效应。
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