【摘 要】
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RNA干扰(RNA interference, RANi)是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引发,使得mRNA降解或翻译被抑制的现象,在真核生物中高度保守。根据生物学机制和所结合Argonaute
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RNA干扰(RNA interference, RANi)是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引发,使得mRNA降解或翻译被抑制的现象,在真核生物中高度保守。根据生物学机制和所结合Argonaute (Ago)蛋白的不同,RNAi在生物体内存在三条通路：小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、小RNA(microRNA, miRNA)和PIWI互作RNA (PIWI-interacting RNA, piRNA)。虽然RNAi通路的核心元件在大多数生物中是保守的,但昆虫中它们的保守程度却不尽相同。而小菜蛾是目前全球分布的重要十字花科害虫,在虫体中能够实现RNAi。因此,我们利用小菜蛾基因组和转录组数据,依据秀丽隐杆线虫、果蝇、赤拟谷盗和家蚕的相关信息,筛选出RNAi通路中的核心元件。本研究中,在小菜蛾中发现2个Dicer基因、1个Drosha、基因5个Argonaute基因、1个Pasha基因和1个Loquacious基因,但并没有发现R2D2基因。并且对这些基因在小菜蛾中不同发育阶段和组织中的表达模式通过qPCR进行了分析。作为RNAi通路中的核心元件,Dicer-1蛋白主要在miRNA通路中发挥作用,Dicer-2蛋白则是siRNA形成中至关重要的。本研究中,对小菜蛾Dicer-1 (PxDcr-1)基因CDS的全长和小菜蛾Dicer-2 (PxDcr-2)基因CDS的全长首次进行了克隆和分析,并且通过RNAi实验对PxDcr-2基因的功能进行了初步探索。PxDcr-1基因的CDS全长为8457 bp,氨基酸序列长度为2818 aa；PxDcr-2基因的CDS全长为5,091bp,氨基酸序列长度为1,696 aa。通过氨基酸序列比对和进化树分析,PxDcr-1和PxDcr-2蛋白都与鳞翅目昆虫同源性最高,特别是黑脉金斑蝶。在RNAi干扰的实验中,dsDcr-2-2对PxDcr-2的1rnRNA表达量的抑制效果最佳,但在注射dsRNA后,在生长发育过程中没有明显的表型变化。为了研究PxDcr-2在小菜蛾siRNA通路中的作用,将dsDcr-2-2和dsBursa/dsCYP同时向虫体注射,发现小菜蛾蛹的畸形率和死亡率与单独注射dsBursa/dsCYP相比,有所下降,说明PxDcr-2在小菜蛾RNAi通路中发挥了作用。
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