基于RNA测序探究黑灵芝多糖间接调节肠黏膜树突状细胞免疫功能的作用机制

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灵芝(Ganoderma atrum,G.atrum)作为一种珍稀的药食两用菌,在中日韩等东方国家已有很长的使用历史。作为黑灵芝中一种重要的成分,多糖已经被证明具有包括抗氧化、抑制肿瘤生长、调节机体免疫在内的多种生物活性。前期研究以从江西省赣南地区人工种植的黑灵芝中提取纯化的黑灵芝多糖(G.atrum polysaccharide,PSG-1)为研究对象,已经证明PSG-1可直接与树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面受体接触,从而激活DCs的免疫应答。但PSG-1作为一种大分子化合物,无法直接穿过肠上皮细胞刺激位于肠黏膜中的DCs。本研究建立了Caco-2/DCs共培养模型,然后通过RNA-seq全面筛选PSG-1处理或未处理的Caco-2和DCs转录本,并基于RNA-seq结果,探究PSG-1在肠上皮阻隔下对其内部免疫细胞的作用,以及PSG-1对于二者之间“对话”的影响。主要结论归纳如下:一、基于RNA测序,成功获得了PSG-1刺激Caco-2/DCs共培养模型前后DCs的转录组信息,共筛选差异表达基因2293个,其中上调基因1180个,下调基因1113个。对于所得DEGs进行GO富集分析,多数显著富集的GO功能集与“免疫”相关,表明PSG-1在Caco-2/DCs共培养模型中仍然可以影响DCs的免疫功能;对其进行KEGG富集分析,鉴定出109条显著富集通路,其中与“环境信息处理”相关的通路有10条,包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“NF-κB信号通路”和“MAPK信号通路”。二、PSG-1可以间接刺激Caco-2/DCs共培养模型下室DCs的免疫功能。PSG-1刺激Caco-2/DCs共培养模型后,下室DCs细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)以及趋化因子(RANTES、MCP-1、MIP-1α)的表达显著增加,对NF-κB和MAPK通路关键蛋白进行检测,发现下室DCs中NF-κB和MAPK通路被活化。以上结果表明,PSG-1通过间接促进Caco-2/DCs共培养模型中DCs炎症相关因子的分泌,进一步调节DCs的免疫功能,其中树突状细胞NF-κB和MAPK通路的活化起重要作用。三、基于RNA测序,成功获得了PSG-1刺激Caco-2/DCs共培养模型前后Caco-2的转录组信息,共筛选差异表达基因452个,其中上调基因196个,下调基因256个。对于所得DEGs进行GO富集分析,前3个富集最显著功能集均与“细胞因子”相关,指示了细胞因子在PSG-1通过Caco-2调控DCs免疫功能的过程中的重要作用。对于所得DEGs进行KEGG富集分析,鉴定出53条显著富集通路,其中与“环境信息处理”相关的通路有5条,包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“TNF信号通路”和“NF-κB信号通路”。四、在Caco-2/DCs共培养模型中,PSG-1通过Caco-2的TNF-α和NF-κB信号通路间接调控DCs免疫功能。TNF-α和NF-κB抑制剂处理Caco-2后,被PSG-1间接刺激的DCs的细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)和趋化因子(RANTES、MCP-1、MIP-1α)的分泌显著降低,此外,由PSG-1间接介导的NF-κB通路和MAPK通路活化均被抑制。
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