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[背景与目的]葛根总黄酮(puerariae radix flavones, PRF)是葛根的主要活性成分。近5年,课题组发现0-50μg/mlPRF呈浓度、时间依赖性诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡,并使NB4细胞周期进程阻滞于S期。此外,PRF诱导NB4细胞凋亡中,JNK蛋白被激活,磷酸化水平上调；ERK表达上调；p38表达下调；caspase3剪切体表达增多。本研究在前期研究基础上采用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580. ERK抑制剂U0126. caspase抑常剂Z-VAD-FMK分别阻断JNK、p38、ERK、caspase信号通路,检测0-50μg/mlPRF对NB4的增殖抑制作用及相关凋亡信号分子的变化,进一步探讨PRF诱导NB4细胞凋亡的分子机制。[方法]1.0.10.30、50μg/ml PRF±10μmol/L SP600125、10μmol/L SB203580.10μmol/L U0126.20μmol/L Z-VAD-FMK作用于NB4细胞24、48及72小时,MTT法检测NB4细胞的增殖抑制率。2.10 μg/ml PRF±10μmol/L SP600125干预NB4细胞24、48、72小时后,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。3.0.10、30.50μg/ml PRF±10μmol/L SP600125干预NB4细胞48小时,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。4.0.10、30.50μg/ml PRF±20μmol/L Z-VAD-FMK干预NB4细胞48小时,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。5.30μg/mlPRF±SP600125、SB203580、U0126、Z-VAD-FMK干预NB4细胞48小时,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。6.30μg/mlPRF干预NB4细胞0小时、12小时、24小时、36小时、48小时后,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。[结果]1.10μg/mlPRF联合SP600125对NB4细胞的增殖抑制率较单药组明显增强；30μg/mlPRF联合SP600125组对NB4的增殖抑制率明显高于PRF单药组,但随着PRF作用时间延长,差异逐渐缩小,干预72小时,联合组与单药组无明显差异；50μg/mlPRF联合SP600125组和单药组对NB4细胞的增殖抑制率无明显差异。2.PRF对NB4细胞的增殖抑制作用被Z-VAD-FMK抑制,随着PRF作用时间延长,联合组和单药组的差异逐渐增大。3.SB203580、U0126不明显影响PRF对NB4细胞的增殖抑制率。PRF联合SB203580/U0126组和单药组的增殖抑制率无差异。4. 10μg/mlPRF处理NB4细胞24、48、72小时后JNK、caspase3、Bcl-2、p-bcl-2表达上调,JNK呈时间依赖性上调,caspase3和Bcl-2, p-bcl-2在48小时表达最高；联合SP600125后,p-bcl-2表达上调,干预24小时,JNK、caspase3、bcl2蛋白较单药组表达增加,干预48、72小时,JNK、caspase3、bcl2较单药组表达降低。5.0-50μg/mlPRF干预NB4细胞48小时,JNK蛋白表达水平呈浓度依赖性上调,caspase3表达水平上调,Bcl-2表达水平下调,CDK2-cyclinA表达上调,p53表达无明显变化；Z-VAD-FMK预处理NB4细胞2小时,JNK表达水平上调,caspase3, p53表达水平下调,bcl-2表达较单药组轻度上调,CDK2、cyclinA表达水平都较单药组上调；SP600125预处理NB4细胞,JNK、caspase3表达水平较单药组下调；ERK表达受抑,Bcl-2表达上调。6.30μg/mlPRF处理NB4细胞48小时,caspase3、JNK、ERK、p53表达上调,Bax表达下调；联合p38抑制剂组较之单用药物组可见JNK、caspase3、Bax、p53和ERK表达均上调；联合JNK抑制剂组、ERK抑制剂组和caspas抑制剂组较之单药组JNK、ERK、p53、caspase3表达下调,Bax表达上调；7.30μg/mlPRF处理NB4细胞不同时间,随着作用时间的延长,JNK表达水平逐渐增加,仅在24小时轻度下调；p38表达下调；ERK表达水平在12小时上调,之后逐渐下调；caspase3表达水平明显上调；CDK2表达水平上调,12小时达高峰；p53表达水平无明显变化[结论]结合课题组前期研究结果,本研究认为PRF诱导NB4细胞凋亡的分子机制可能根据PRF浓度和处理时间有所不同,虽然10、30、50μg/mlPRF都能激活JNK通路,但激活的JNK通路可能既参与细胞凋亡程序的激活也活化细胞生存信号。低浓度PRF或者短时间处理可能一过性激活JNK,生存信号占优势,促进细胞增殖,但是否诱导细胞分化成熟还需进一步证明；提高PRF浓度或延迟处理时间导致JNK持续活化,凋亡信号占优,激活凋亡程序。凋亡过程中,p38、ERK通路都与JNK通路发生联系,共同调节细胞凋亡的发生,但p38、ERK并不是PRF诱导NB4细胞凋亡中不可或缺的信号分子。此外,本研究还进一步证实了PRF引起NB4细胞周期阻滞的分子机制,主要与cyclinA-CDK2的异常表达有关。CyclinA-CDK2表达水平上调,加速细胞进入S期,导致DNA复制紊乱,促进凋亡发生。